Les sites de reconnaissances anionique

A.5.1.2. Les sites de reconnaissances anionique Les sites de reconnaissances anionique

La réaction catalysée par les GAPDH phosphorylantes fait intervenir alternativement le

glycéraldéhyde-3-phosphate et le phosphate inorganique ou le 1,3-diphosphoglycérate. De ce fait,

pour accueillir les deux groupements phosphate, deux sites de reconnaissance anionique sont

nécessaires et ont d'ailleurs été mis en évidence dès la résolution de la première structure

cristallographique de GAPDH phosphorylante (enzyme de homard) par l'équipe de Rossmann en

1975. Comme précédemment présenté en A.3.2.2.2, la modélisation de l'intermédiaire

hémithioacétal dans la structure de la GAPDH de homard a conduit les auteurs à proposer la

dénomination Pi et Ps pour chaque site, les indices i et s renvoyant respectivement au phosphate

sites ainsi que les acides aminés impliqués dans leur formation n'ont été précisés que plus tard,

grâce à la structure tridimensionnelle de l'enzyme de B. stearothermophilus obtenue à haute

résolution (1,8 Å) (Skarzynski et al., 1987). Le site actif de cette structure (code pdb 1gd1) avec les

deux anions sulfate indiquant la position des sites Pi et Ps est présenté en Figure I-9. Il faut noter,

qu'à nouveau, les auteurs soulèvent des interrogations quant au véritable rôle de chacun des deux

sites de reconnaissance anionique au cours de la catalyse. Comme nous le verrons ensuite (cf. en

A.5.1.2.3.), de nombreux travaux ont été réalisés à ce sujet sans toutefois pouvoir attribuer de

manière univoque leur fonction respective. Néanmoins, de manière à faciliter les comparaisons, les

dénominations Pi et Ps ont été conservées.

A.5.1.2.1. Le site Ps

Le site Ps, dans la structure de la GAPDH de B. stearothermophilus, est occupé par un anion

sulfate qui forme des liaisons hydrogène avec les chaînes latérales des résidus conservés Thr179 et

Arg231. La fonction hydroxyle portée par le ribose adjacent au nicotinamide (NAD) en position 2'

forme, elle aussi, une liaison hydrogène avec la molécule de sulfate. La contribution de la partie

ribose du cofacteur semble essentielle à la constitution d'un site de reconnaissance anionique Ps

complètement fonctionnel. En effet, la densité électronique observée au niveau de ce site dans la

structure de l'apoenzyme est plus faible, signe d'une occupation partielle de l'anion sulfate en

l'absence du cofacteur (Skarzynski et al., 1987).

La localisation exacte du site Ps ainsi que sa géométrie sont très conservés dans l'ensemble

des structures de GAPDH de bactéries et d'eucaryotes. Seule l'Arg231 présente, dans certains cas,

une variabilité conformationnelle. Ainsi, la chaîne latérale de cet acide aminé, dans les structures de

la GAPDH isolée à partir d'E. coli (Duée et al., 1996) ou de Trypanosoma cruzi (Souza et al.,

1998 : structure non disponible dans la PDB) adopte une conformation distincte de celle rencontrée

dans la structure de B. stearothermophilus et forme un pont salin avec le résidu Asp192 (ou, en

position équivalente, l'Asp210 pour T. cruzi). Toutefois, d'autres structures de GAPDH issues de

ces deux organismes montrent une conformation tout à fait classique de l'Arg231, comparable à

celle observée dans la structure de B stearothermophilus et ce, en l'absence ou en présence d'un

ligand dans le site Ps (Yun et al., 2000 pour la GAPDH d'E. coli : 1dc3, 1dc4, 1dc5 et 1dc6 ;

Castilho et al., 2003 et Ladame et al., 2003 pour la GAPDH de T. cruzi : code pdb 1ml3 et 1qxs,

respectivement).

Figure I-9 : Vue stéréoscopique des sites de reconnaissance anionique Pi et Ps de la structure de B.

stearothermophilus selon la position de deux ions sulfate (Skarzynski et al., 1987).

les mêmes que celles rencontrées dans les autres GAPDH. Ce site est constitué de deux résidus

arginine en position 166 et 167 de la séquence de Sulfolobus solfataricus (position 167-168 dans

celle de Methanothermus fervidus) qui sont conservés dans l'ensemble des GAPDH d'archaea.

Néanmoins, ce site n'ayant été identifié que dans une structure sous forme apoenzyme (Isupov et

al., 1999), on ne peut exclure que le NAD, une fois présent, puisse contribuer à la formation de ce

site de reconnaissance anionique et influencer sa position.

A.5.1.2.2. Le site Pi

Dans la structure de l'holoenzyme de B. stearothermophilus, le site Pi est partiellement

occupé par un ion sulfate. Celui-ci est stabilisé par l'établissement de liaisons hydrogène avec les

chaînes latérales des résidus conservés Ser148 et Thr208 ainsi qu'avec l'azote de la chaîne

principale de la Gly209. Les chaînes latérales des résidus Arg195, Thr150 et la fonction hydroxyle

en 2' du ribose sont indirectement impliquées dans la stabilisation de l'anion sulfate au travers de

molécules d'eau cristallographiques. L'Arg195, contrairement à la Thr150, n'est pas conservée dans

les séquences de GAPDH phosphorylantes mais est une singularité des GAPDH issues

d'organismes thermophiles. Il faut noter que le résidu Arg194, invariant chez les organismes

mésophiles, n'est pas structuralement équivalent à l'Arg195 des organismes thermophiles puisque la

superposition des différentes structures exclut toute contribution de ce résidu à la formation du site

Pi (Duée et al., 1996).

Si la position exacte du site Ps est très similaire dans l'ensemble des structures de GAPDH,

le site Pi, lui, semble avoir une localisation moins précise, variable d'une structure à l'autre. Ainsi, la

position de ce site de reconnaissance anionique semble liée à la conformation d'une boucle du site

actif, la boucle β2-α2 (Thr207-Ala210) qui contient les résidus Thr208 et Gly209 et borde le site Pi.

Cette boucle a été observée sous deux conformations différentes. La première, celle présente dans la

structure de l'enzyme de B. stearothermophilus et considérée comme la conformation classique, est

la plus fréquemment rencontrée. La seconde est observée dans les structures de la GAPDH de

Thermotoga maritima (code pdb 1hdg), Leishmania mexicana (1gyp et 1a7k), Palinurus versicolor

(avec la cystéine carboxyméthylée : 1dss), et E. coli (avec la cystéine acylée par le G3P : 1dc4)

(Korndörfer et al., 1995 ; Kim et al., 1995 et 1998 ; Song et al., 1999 ; Yun et al., 2000). Bien que

cette conformation particulière ait été initialement obtenue en présence de sulfate pour l'enzyme de

T. maritima, Kim et al. (1998) ont suggéré que cette conformation de la boucle β2-α2 soit associée,

dans la structure de l'enzyme de L. mexicana, à la présence d'un anion phosphate plus représentatif

de l'état physiologique que l'ion sulfate. Les deux structures de P. versicolor et d'E. coli obtenues

ensuite, avec leur cystéine catalytique respectivement carboxyméthylée ou acylée par le G3P

(hémithioacétal), semblent plutôt indiquer que cette conformation de la boucle β2-α2 est liée à l'état

de la cystéine. En effet, les structures des GAPDH de ces deux organismes ont, par ailleurs, été

déterminées avec leur cystéine sous forme libre (Song et al., 1998 : 1szj ; Duée et al., 1996 : 1gad et

1gae ; Yun et al., 2000 : 1dc3, 1dc5, 1dc6) et dans ces structures, la boucle 207-210 adopte une

conformation comparable à celle de l'enzyme de B. stearothermophilus. Comparée à la

conformation classique, la seconde conformation de cette boucle est déplacée vers la cystéine

catalytique et délimite une nouvelle position du site Pi distante de plus de 3Å de la précédente et qui

a été appelée "new Pi" ou nouveau site Pi (Figure I-10).

Chez les archaea, la position de l'anion sulfate assimilée au site Pi est différente du site Pi

identifié dans la structure de B. stearothermophilus. Néanmoins, cette localisation est quasiment

identique à celle du nouveau site Pi, l'atome de soufre des sulfates présent dans les structures de S.

solfataricus (1b7g) et M. fervidus (1cf2) étant situé, après superposition des chaînes principales des

trois structures, à environ 0,5Å de l'atome de phosphore du phosphate de la structure de T. maritima

(1hdg). Ce site Pi est constitué, chez les archaea, des chaînes latérales des résidus Ser138

(équivalente à la Ser148 de B. stearothermophilus), Asn148 (qui contribue grâce à l'atome d'azote

de sa chaîne principale), His192 et His193 qui sont strictement conservés dans les séquences des

GAPDH d'archaea.

A.5.1.2.3. Apport de la mutagenèse-dirigée à l'étude des sites de

reconnaissance anionique

L'ensemble des résidus de l'enzyme de B. stearothermophilus dont la chaîne latérale

contribue à la formation de l'un ou l'autre des sites de reconnaissance anionique ont été substitués

par mutagenèse dirigée et les propriétés cinétiques des mutants comparées à celles de l'enzyme de

type sauvage (Corbier et al., 1989 ; Corbier et al., 1994 ; Michels et al., 1996). En cinétique

classique, les résultats obtenus ne montrent que peu de changement pour les constantes

michaeliennes, signe que la mutation d'un seul résidu ne perturbe que très légèrement la fixation des

substrats. On peut noter toutefois que la mutation de la Ser148 en alanine, résidu participant à la

formation du site Pi, affecte en premier lieu le KM du phosphate inorganique (et dans une moindre

mesure les Km du 1,3-DPG et du G3P), laissant supposer que ce résidu interagit avec ce site, en

accord avec les résultats de modélisation moléculaire (Corbier et al., 1989). Si l'altération des sites

Pi et Ps ne semble avoir qu'une influence limitée sur l'affinité des substrats, la mutation des résidus

du site Ps conduisent néanmoins à des altérations très fortes des constantes catalytiques (diminution

Figure I-10 : Comparaison des deux conformations de la boucle β2-α2 (207-210) et relocalisation du site

Pi. Les structures de la GAPDH de B. stearothermophilus (1gd1) et de T. maritima (1hdg) sont représentées

respectivement en orange et en bleu, avec leur anion sulfate fixé respectivement dans les sites Pi et nouveau

d'un facteur 27, 4667, 467 et 2333 respectivement pour les mutants T179A, T179M, R231G et

R231L par rapport à l'enzyme de type sauvage). Les constantes catalytiques des mutants du site Pi

sont, elles, moins perturbées (facteur 9,3, 6,5, 2,4 et 11 pour les mutants S148, T208A, T150A et

R195L, respectivement).

Les études, en stopped-flow, des étapes individuelles de la réaction montrent que du point

de vue cinétique, le processus global conduisant à la formation de NADH n'est pas altéré pour les

mutants du site Ps par rapport à l'enzyme sauvage alors que ce processus est ralenti de 3 à 24 fois

pour les mutants du site Pi, suggérant que le groupement phosphate du substrat interagit avec les

résidus du site Pi lors de l’étape d’acylation. En l'absence de méthode directe pour étudier l'étape de

phosphorolyse, les constantes de premier ordre associées à cette étape ont été prédites en se basant

sur la détermination des constantes de second ordre. Pour la plupart des mutants des sites Pi et Ps (à

l'exception du mutant T150A), ces constantes sont proches du kcat, indiquant que l’étape de la

phosphorolyse, ou un processus qui lui est associé, devient limitante pour les mutants.

En conclusion, ces études tendraient donc à soutenir l'hypothèse d'une interaction entre le

phosphate du substrat et le site Pi durant l'étape d'oxydo-réduction. Pourtant, le fait que l'étape de

phosphorylation (ou une étape associée) devienne limitante pour les mutants des deux sites ne

permet aucune conclusion quant à un éventuel changement de site du phosphate du substrat à partir

de Pi vers Ps.

A.5.2. Structures cristallographiques de complexes

Dans le document Caractérisation Structurale et Fonctionnelle de deux Enzymes de la Famille des Aldéhyde déshydrogénases : la Glycéraldéhyde-3-Phosphate Déshydrogénase de B. stearothermophilus et l'Erythrose-4-Phosphate Déshydrogénase d'E. coli. : structures cristallograp (Page 39-45)