Protein expression and purification

Os músculos dos peixes vivos são estéreis. Imediatamente após a captura, a flora bacteriana se encontra em três localizações principais: na superfície ou no limo externo, nas guelras e nas vísceras. Em função do tempo e da temperatura de conservação, dois tipos de deterioração poderão se desenvolver, uma enzimática e outra bacteriana (JAY, 1978).

UCHYAMA e EHIRA (1974), citados pela FAO (1995), mostraram que, para o bacalhau (Gadus morhua) e o atum (Thunnus thynnus), o metabolismo enzimático influencia o frescor destas espécies e não se relaciona com as qualidades microbiológicas. Em determinadas espécies, a autólise enzimática predomina imediatamente após a captura, somando-se aos processos microbiológicos que acontecem logo em seguida, acelerando a deterioração do peixe resfriado. Após a morte, o suprimento de oxigênio nos tecidos musculares é interrompido porque o sangue não é mais bombeado pelo coração e, não atinge as guelras (órgãos importantes na manutenção da respiração dos peixes e de alguns anfíbios). Não somente o oxigênio tem importância na manutenção da respiração, mas também a produção de energia proveniente da ingestão de nutrientes.

Segundo BRAVERMAN (1976), o glicogênio, as proteínas ou o lipídio são oxidados por meio de enzimas tissulares numa série de reações aeróbicas ou anaeróbicas para produzirem produtos finais como: CO2, ATP e H2O. Apesar de

atmosférico, mesmo que por um período limitado, o processo aeróbico sempre dependerá da presença contínua do oxigênio, utilizando o sistema circulatório. Sob condições anaeróbicas, a adenosina tri - fosfato (ATP) pode ser sintetizada para a obtenção de energia por duas importantes vias: a creatina fosfato e a arginina fosfato, restrita ao músculo dos vertebrados (peixes teleósteos). Alguns invertebrados como os cefalópodes mostram características relacionadas com a segunda via, a arginina fosfato. Mas, em ambos os casos, a produção de ATP é interrompida quando a creatina ou a arginina fosfato são consumidas. Para a maioria dos teleósteos, a glicólise é a única via possível para a produção de energia quando o coração pára de bater. E este fenômeno tem como produtos finais, o ácido lático e o pirúvico. Normalmente, 2 moléculas de ATP são produzidas na via glicolítica por molécula de glicose oxidada, se comparada com as 36 de ATP produzidas por molécula de glicose quando os produtos finais são oxidados aerobicamente na mitocôndria, no peixe vivo. Após a morte, quando a anaerobiose muscular não consegue manter o nível de ATP ou quando este índice intracelular se reduz de 7 ou 10 µmoles para menos de 1 µmol.g-1 _{de tecido, o músculo entra no rigor mortis.}

Segundo WHEATON e LAWSON (1985), a glicólise post mortem resulta na acumulação de ácido lático com uma redução no pH muscular.

Para o bacalhau (Gadus morhua), a redução do pH pode variar de 6,8 para 6,1 e, em outras espécies a redução pode até ser mais acentuada. Para a cavalinha- de-reis (Decaptereus macarellus), o pH pode atingir 5,8 a 6 e, para o atum (Thunnus

thynnus), 5,4 a 5,6. Entretanto, conforme vários trabalhos (BERTULLO, 1975;

WHEATON e LAWSON, 1985; KAI e MORAIS, 1988; FAO, 1995), estes valores no

post mortem não são comuns para a maioria dos teleósteos marinhos, assim como

para os músculos dos mamíferos. No processo metabólico, o conteúdo de ácido lático produzido é proporcional ao teor de carboidrato (glicogênio) disponível no tecido vivo. O músculo dos peixes apresenta um reduzido teor de glicogênio comparado com o dos mamíferos, gerando menos quantidade de ácido lático após a morte.

Segundo JAY (1978), pelos níveis relativamente altos de glicogênio, a deterioração de moluscos é basicamente fermentativa e, indica a determinação do pH como referencial para estabelecer a qualidade microbiológica deste pescado. Aparentemente, a medida do pH é mais significativa que a determinação de bases voláteis nitrogenadas, para detectar alterações na maioria dos moluscos.

O estado nutricional do peixe e o estresse na captura têm um grande efeito no residual de glicogênio acumulado e conseqüentemente no pH do post mortem. CHIBA et al. (1991) comprovaram que alguns minutos de estresse antes da captura resultam em uma diminuição de 0,5 unidade de pH em 3 horas, para 0,1 unidade no mesmo período, relacionado a uma captura não estressada. A redução do pH do peixe no post mortem tem um efeito sobre as propriedades físicas do músculo. Quando o pH reduz, há uma desnaturação parcial das proteínas com a diminuição da capacidade de absorção de água.

Somente a ATP não supre a necessidade energética exigida para a contração muscular. Esta contração é controlada por íons Ca+2 _{e por algumas enzimas, como}

as ATPases que podem ser encontradas em muitas células musculares. Quando o valor da concentração dos íons Ca+2 intramuscular é maior que 1µmol, estes íons ativam as ATPases, reduzindo o conteúdo de ATP livre no músculo, resultando em uma interação entre as proteínas actina e miosina, causando a contração. Isto tem como resultado, o encurtamento das fibras com posterior rigidez muscular (FAO, 1995).

A passagem pelo estado de rigor mortis é uma operação rápida, resultando no relaxamento do tecido muscular, causado pela ativação de uma ou mais enzimas tissulares que digerem componentes complexos de forma contínua. A flacidez muscular após o rigor mortis e, eventualmente a deterioração, coincide com as variações autolíticas. Entre as transformações metabólicas que se desenvolvem após a morte, uma das primeiras a serem reconhecidas foi a degradação da ATP para a formar adenosina di - fosfato (ADP), adenosina mono - fosfato (AMP), inosina mono - fosfato (IMP), inosina (Ino) e hipoxantina (Hx). O catabolismo da ATP se processa da mesma maneira para todos os peixes, mas a velocidade individual de cada reação, de um catabólito para outro, varia entre as espécies e esta progressão coincide com as características da deterioração. De acordo com a FAO (1995), o frescor do peixe, baseado nestas mudanças autolíticas, pode ser definido pela expressão:

[

]

[

]

K (%) = x 100

[

]

[

]

[

]

[

]

[

]

[

]

Assim que, [ATP], [ADP], [AMP], [IMP], [Ino] e [Hx] representam a concentração média destes compostos no músculo do peixe, medida em vários tempos no período de conservação. O valor K ou índice de frescor tem por base as trocas autolíticas que acontecem no post mortem durante a estocagem do músculo. Um alto valor de K significa um baixo frescor. A degradação de nucleotídeos é apenas coincidente com as trocas percebidas em relação ao frescor e não necessariamente relatam a causa da deterioração. Apenas a concentração de hipoxantina pode ser considerada como responsável, com efeito, na produção de odores do peixe deteriorado, assim como, é normalmente aceito que a inosina mono-fosfato é a responsável pelo desejável sabor presente nos produtos de boa qualidade.

SURETTE et al. (1988), citados pela FAO (1995), estudaram a autólise do bacalhau (Gadus morhua) submetido a uma operação de esterilização e a relacionaram com o catabólito ATP. As relações de formação e redução da IMP para ambas as amostras, esterilizadas ou não, indicam que a via catabólica para a degradação da adenosina tri – fosfato, através da inosina, é exclusivamente devido às enzimas autolíticas. A conversão da inosina para hipoxantina é acelerada, em mais ou menos 2 dias para as amostras não esterilizadas, sugerindo que a enzima bacteriana nucleotídeo fosforilase é a maior responsável pela produção de hipoxantina no post mortem, da amostra refrigerada. Existe uma variação na degradação dos vários nucleotídeos entre as espécies de pescado, indicando uma variação no conteúdo de hipoxantina. Entretanto, a determinação de hipoxantina não apresenta valores iguais para espécies semelhantes.