(Sporulation inhibitor of replication protein A et Sporulation stage 0protein A,
respectivement) prot´eines impliqu´ees dans la s´equestration d’ori chezB. subtilis et
ses proches voisins taxonomiques seulement.
1.4.1.1 Structure des origines de r´eplication
L’origine de r´eplication d’un chromosome bact´erien typique est une courte s´equence
nucl´eotidique (250 pb chezE.coli; Figure1.3), organis´ee en une r´egion riche en Ad´enine
et Thymine et en di↵´erents motifs structuraux [Rajewska et al., 2012; Robinson and
Bell,2005].
Figure 1.3: Origine de r´eplication deE. coli.
Adapt´e de [Mott and Berger,2007]. DUE : DNA Unwinding Element, riche en bases A+T. R1, R2, R3, R4 : boˆıtes DnaA orient´ees. Motifs pr´esentant une affinit´e forte pour DnaA : bleu sombre, et faible : bleu clair. Rectangles blancs : sites de fixation de IHF et Fis. ´Etoiles : motifs GATC. Rectangles gris : sites I de fixation pr´ef´erentielle de DnaA-ATP. Fl`eches : quatri`eme classe de motifs de fixation de DnaA-ATP exclusivement, dans DUE.Sa proximit´e avec certains g`enes engendre plusieurs syst`emes de r´egulation. La plus
im-portante interaction est avec DnaA, au niveau des boˆıtes DnaA qui structurent l’origine
de r´eplication par leur type et leur orientation et permettent l’ouverture d’ori au cours
d’un changement de conformation lors de la fixation de DnaA [Mott and Berger,2007].
La r´egion riche en bases A et T (DNA Unwinding Element ; DUE) est le site d’ouverture
proprement dit. Relativement moins d’´energie sera n´ecessaire `a son ouverture de par
sa richesse en paires A-T (2 liaisons covalentes) en comparaison `a une r´egion d’ADN
comprenant des appariements G-C (3 liaisons covalentes). Cette r´egion contient de plus,
sur le chromosome d’E. coli, trois 13-m`eres caract´eristiques organis´es en tandem,
im-pliqu´es dans l’activit´e de DnaA [Mott and Berger,2007]. D’autres motifs structurels de
cette r´egion participent `a la r´egulation de l’initiation, tels que les motifs d’attache de Fis
et IHF et les motifs GATC. L’organisation des ori des chromosomes d’autres bact´eries
pr´esentent de nombreuses similarit´es avec l’ori d’E.coli et respectent la structure DUE
+ motifs sp´ecifiques (boˆıtes DnaA, site de m´ethylation de Dam, etc) (Figure1.4).
La structure desori plasmidiques pr´esente certaines sp´ecificit´es :
• La structure des ori des plasmides `a r´eplication thˆeta pr´esente une organisation
si-milaire `a celles des chromosomes : DUE + motifs structuraux (Figure 1.4). De
nombreuses origines plasmidiques comportent des boˆıtes DnaA [Rajewska et al.,
2012], ce qui indique l’existence d’une interaction forte entre des r´egulateurs de
l’hˆote et la r´eplication plasmidique [Kr¨uger and Rakowski,2004]. Lesori
plasmi-diques peuvent ´egalement poss´eder des motifs sp´ecifiques organis´es en tandem, les
it´erons, qui permettent la fixation des prot´eines Rep et ainsi l’ouverture d’ori.
Figure 1.4: Diversit´e des origines de r´eplication des r´eplicons bact´eriens
chromoso-miques et plasmidiques.
Adapt´e de [Rajewska et al.,2012].• L’origine de r´eplication chez les plasmides de type RC est un peu particuli`ere car elle
comporte deux origines : dso (double strand origin) et sso (singlestrand origin).
La premi`ere est le lieu d’ouverture de l’ADN double brin. Elle comprend deux
sites sp´ecifiques :nick, lieu de la coupure de l’ADN, et bind, lieu de fixation de la
prot´eine Rep. C’est `a son niveau que s’amorce la r´eplication d’un des deux brins.
L’autre origine,sso, est l’endroit o`u est initi´ee la r´eplication de l’autre brin [Khan,
2005].
• Les plasmides SD sont majoritairement les plasmides de la famille IncQ [Loftie-Eaton
and Rawlings,2012]. Leur origine est structur´ee en trois it´erons correspondant au
site de fixation de RepC, deux r´egions riches en G+C et A+T, respectivement, et
deux sites d’initiation simple brin : ssiAetssiB (singlestrandinitiation A et B).
1.4.1.2 D´eroulement de l’initiation
• Dans le mod`ele classique de l’initiation de la r´eplication du chromosome, l’attachement
de plusieurs DnaA sur les boˆıtes DnaA d’ori provoque une distorsion de l’ADN
et conduit `a son ouverture. Ce ph´enom`ene est suivi de la formation du complexe
d’initiation (orisome), et de l’action de l’h´elicase sur l’ADN ouvert [Robinson and
Bell, 2005]. Chez E.coli, Fis initialement pr´esent est d´eplac´e, ce qui permet la
fixation de IHF et la formation d’un complexe prot´eique : ler´eplisome [Mott and
Berger, 2007; Zakrzewska-Czerwi´nska et al., 2007]. L’ouverture est stabilis´ee par
la fixation de prot´eines SSB qui prot`egent l’ADN simple brin.
• L’initiation de la r´eplication thˆeta des plasmides est assez similaire `a celle du
chromo-some bact´erien : la fixation des prot´eines Rep sur les it´erons provoque un
chan-gement de conformation de l’origine ce qui entraˆıne son ouverture. Des facteurs
additionnels (DnaA, IHF, Fis, IciA, SeQ) peuvent int´eragir avec Rep ou se fixer `a
l’ori afin de stabiliser/d´estabiliser le complexe [Kr¨uger and Rakowski,2004].
• Chez les plasmides RC l’ouverture de l’ADN s’e↵ectue au niveau du site nick du site
sdo par fixation de la prot´eine Rep. Rep recrute ensuite une h´elicase sp´ecifique de
l’hˆote, PcrA (Plasmid copy number reduction protein A), qui ´etend l’ouverture.
Un manteau de prot´eines SSB stabilise un des brins de l’ADN pendant que le
compl´ementaire de l’autre brin est synth´etis´e par l’ADN polym´erase III de l’hˆote.
La r´eplication du deuxi`eme brin commence au sitessoet fait ´egalement intervenir
la machinerie r´eplicative de l’hˆote : ADN polym´erase I et III, ADN gyrase et ADN
ligase [Khan,2005].
• L’initiation de la r´eplication des plasmides SD commence par la fixation de RepC au
niveau des it´erons, ce qui induit une rupture de la structure de l’origine et conduit
`
a son ouverture. RepA p´en`etre alors dans l’ouverture et catalyse le d´eroulement de
l’ADN. Lorsqu’ils sont `a d´ecouvert, les sitesssiAetssiB sont reconnus par RepB
qui permet la fixation de l’ADN polym´erase III et le d´ebut de la r´eplication grˆace
aux amorces synth´etis´ees par RepB [Loftie-Eaton and Rawlings,2012].
Contrairement `a certains plasmides `a r´eplication thˆeta, les plasmides SD et RC
n´ecessitent une intervention r´eduite des prot´eines de l’hˆote. Il est alors int´eressant de
constater qu’au final, l’initiation de la r´eplication du chromosome n’est qu’un
cas particulier de celle des plasmides thˆeta.
1.4.1.3 R´egulation de l’initiation
Les mod`eles classiques de r´egulation de l’initation de la r´eplication impliquent
majori-tairement deux types de processus selon leur cible :
– La s´equestration, la d´estabilisation ou l’occupation d’ori et de ses motifs structuraux.
– L’inactivation, la s´equestration ou la r´egulation des prot´eines initiatrices, Rep et
DnaA.
L’initiation de la r´eplication du chromosome est tr`es pr´ecis´ement r´egul´ee pour garantir
qu’une unique r´eplication du chromosome aura lieu au cours d’un cycle cellulaire.
• Les m´ecanismes de s´equestration de l’origine de r´eplication du chromosome chezE. coli
font intervenir les motifs GATC (GANTC chezB. subtilis) et les prot´eines Dam qui
m´ethylent ces sites au niveau de leur ad´enine. Avant initiation de la r´eplication, les
sites GATC de l’origine sont doublement m´ethyl´es sur les brins direct et indirect
(GATC ´etant un palindrome, si on consid`ere son compl´ementaire). Juste apr`es
l’initiation, ces sites se retrouvent h´emim´ethyl´es car le brin n´eo-synth´etis´e n’a
pas encore ´et´e soumis `a l’action de Dam. Cette h´emim´ethylation conduit `a la
fixation de SeqA, ce qui empˆeche la fixation de DnaA au niveau de la nouvelle
origine [Kr¨uger and Rakowski,2004;Mott and Berger,2007]. La s´equestration de
l’ori par SeqA et Dam semble ˆetre une caract´eristique des Ent´erobact´eries, mais
divers m´ecanismes de s´equestration existent pour d’autres bact´eries [
Zakrzewska-Czerwi´nska et al., 2007]. Chez B. subtilis, la s´equestration d’ori se fait par deux
prot´eines non homologues de SeqA, Spo0A et SirA [Katayama et al.,2010].
• La r´egulation de DnaA chezE.coli implique aussi la titration des prot´eines au niveau
d’une s´equence caract´eristique, le locusdatA, avec pour e↵et de r´eduire le nombre
de DnaA actives disponibles.
• Le m´ecanisme RIDA (Regulatory inactivation of DnaA) [Mott and Berger,2007]
per-met le passage de la forme active de DnaA, DnaA-ATP, `a la forme inactive,
DnaA-ADP, par l’intervention des prot´eines HdA et d’une des sous-unit´es de l’ADN
po-lym´erase III chezE. coli [Katayama et al.,2010]. Ces m´ecanismes semblent aussi
exister chez d’autres bact´eries [Zakrzewska-Czerwi´nska et al.,2007].
• DnaA a aussi un rˆole de facteur de transcription en se fixant sur les promoteurs de
certains g`enes. Elle exerce aussi une auto-inhibition de sa synth`ese en se fixant au
promoteur de son g`ene [Zakrzewska-Czerwi´nska et al.,2007].
Di↵´erents m´ecanismes de r´egulation de l’initation sont sp´ecifiques des plasmides.
• Des m´ecanismes de s´equestration d’ori existent ´egalement chez les plasmides. Un
exemple en est lehandcuffing de l’origine de r´eplication des plasmides `a r´eplication
thˆeta et `a it´erons. Les ori des deux plamides n´eo-form´es se lient via les prot´eines
Rep fix´ees, empˆechant leur acc`es [Kr¨uger and Rakowski, 2004].
• Le contrˆole de la disponibilit´e en prot´eines Rep chez les plasmides d´epend
notam-ment de l’auto-r´egulation de la transcription des g`enes rep. Il peut aussi passer
par la structure-mˆeme de l’ori qui peut titrer Rep grˆace `a ses it´erons ou des sites
annexes [Kr¨uger and Rakowski,2004]. Certaines prot´eines initiatrices Rep,
activa-trices dans leur forme monom´erique, peuvent former des dim`eres et alors devenir
inhibitrices de la r´eplication [Cervantes-Rivera et al.,2011;Kr¨uger and Rakowski,
2004]. L’´equilibre thermodynamique ´etant plutˆot en faveur des dim`eres,
l’intro-duction d’un plasmide dans un hˆote qui abrite d´ej`a un plasmide utilisant la mˆeme
prot´eine Rep aura tendance `a ne pas pouvoir se r´epliquer, l’initiation ´etant
di-rectement bloqu´ee par les dim`eres de prot´eines Rep des plasmides pr´esents. Ainsi
les prot´eines Rep interviennent aussi dans les m´ecanismes dit d’“incompatibilit´e
plasmidique”.
• Des inhibitions par intervention d’ARN anti-sens agissant au niveau de la r´egulation
de l’initiation plasmidique ont ´et´e caract´eris´ees [Brantl,2004]. L’inhibition
inter-vient majoritairement dans le blocage de la traduction de l’ARNm des prot´eines
activatrices Rep (par exemple, chez le plasmide R1 d’E. coli) ou en se fixant au
niveau de leurs cibles. Dans le cas des plasmides de type “RepABC”, le g`ene de
l’activateur de l’initiation RepC ´etant inclus dans un op´eron regroupant repA et
repB (homologues deparAetparB, respectivement), la synth`ese de RepC peut ˆetre
pseudo-auto-inhib´ee par RepA et/ou RepB [Pinto et al.,2012], ou inhib´ee par un
ARN antisens dont le g`ene est pr´esent `a l’int´erieur mˆeme de l’op´eron [
Cervantes-Rivera et al., 2011]. Enfin, de nombreuses prot´eines de l’hˆote (DnaA, IHF, Fis)
peuvent intervenir dans la r´egulation des g`enes rep ou participer `a l’inactivation
des prot´eines Rep, ainsi que dans l’activation/inactivation des ori plasmidiques
[Kr¨uger and Rakowski,2004].
1.4.2 Elongation´
Apr`es la formation du replisome, l’ADN est r´epliqu´e bidirectionnellement chez les
chro-mosomes et la majorit´e des plasmides `a r´eplication thˆeta, et unidirectionnellement chez
les autres, les plasmides `a r´eplication RC et SD et certains plasmides `a r´eplication thˆeta.
Les prot´eines cl´e formant les complexes de r´eplication organis´es aux deux fourches de
r´eplication, sont les suivantes :
– une h´elicase faisant passer l’ADN du stade double-brin au stade mono-brin,
– des mol´ecules stabilisatrices de l’ADN mono-brin (SSB),
– des primases synth´etisant des amorces ARN n´ecessaires `a la formation des fragments
d’Okazaki,
– des polym´erases synth´etisant l’ADN et/ou rempla¸cant l’ARN par de l’ADN,
– des syst`emes de correction d’erreur,
– des ligases liant les di↵´erents fragments synth´etis´es.
Deux types de prot´eines additionnelles sont n´ecessaires au bon fonctionnement des
po-lym´erases : des prot´eines d’attache `a l’ADN (pinces), qui forment g´en´eralement un
an-neau glissant autour de l’ADN, et des prot´eines permettant l’´etablissement des prot´eines
pinces sur l’ADN. Les principales prot´eines impliqu´ees dans l’´elongation sont pr´esent´ees
Table 1.7. Une bonne revue des di↵´erents m´ecanismes mol´eculaires impliqu´es dans
l’´elongation peut ˆetre trouv´ee dans [Johnson et al.,2005].
Dans le document
Discrimination analytique des génomes bactériens
(Page 44-48)