A análise cromatográfica de compostos presentes em matrizes complexas normalmente requer um procedimento de pré-tratamento da amostra para se extraírem, isolarem e concentrarem os compostos de interesse [36-38]. Este pré-tratamento da amostra corresponde a uma etapa morosa em laboratório e propensa a perdas dos compostos de interesse [36], contudo é realizado devido à complexidade e à existência de interferentes na matriz envolvida, a incompatibilidades com os sistemas cromatográficos, e porque muitos dos compostos estão presentes em concentrações vestigiais nas amostras [36, 37].
As técnicas de pré-tratamento da amostra mais utilizadas são a extração líquido-líquido (do inglês LLE) e a extração em fase sólida (do inglês SPE) [36, 37]. Contudo, atualmente estão disponíveis inúmeras técnicas extrativas, nomeadamente a microextração em fase sólida (do inglês SPME), a microextração em seringa empacotada (do inglês MEPS), a extração dinâmica em fase sólida (do inglês SPDE), extração por absorção sobre barra de agitação (do inglês
SBSE), entre outras [36, 38-40]. Estas técnicas de microextração são mais rápidas e simples, e
têm em conta a necessidade de utilizar metodologias analíticas mais amigas do ambiente, minimizando o uso de químicos orgânicos tóxicos e a produção de menos resíduos [36, 38].
De forma sumária, nesta subsecção, vai ser descrita a técnica de preparação da amostra bem como a técnica analítica utilizadas no presente trabalho.
1.3.2.1. Extração em fase sólida
A SPE é uma técnica seletiva e rápida de preparação da amostra, e a sua versatilidade permite que seja utilizada para diversos fins, nomeadamente redução da complexidade da matriz, remoção de interferentes, concentração do composto de interesse, e fracionamento da amostra [41-43].
O princípio da SPE é similar ao da LLE, uma vez que envolve a separação de solutos entre duas fases. Contudo, a SPE, em vez de utilizar duas fases líquidas imiscíveis, utiliza uma fase sólida (adsorvente) e uma fase líquida (amostra ou solvente com os analitos) para isolar um composto de interesse a partir de uma solução [41]. O composto de interesse é separado tendo em conta as suas propriedades químicas e físicas, as quais determinam a sua ligação ao adsorvente [42].
A seleção de um adsorvente apropriado depende do mecanismo de interação entre o analito de interesse e o próprio adsorvente, ou seja, depende das propriedades hidrofóbicas, polares e das interações iónicas tanto do analito como do adsorvente. Em SPE, os mecanismos de retenção mais comuns são baseados em forças de Van der Walls (interações não polares), ligações por pontes de hidrogénio, forças dipolo-dipolo (interações polares) e interações catião-anião (interações iónicas) [41].
A SPE depende da interação entre três componentes: adsorvente, solvente da amostra, e composto de interesse. Este último deve ligar-se mais fortemente ao adsorvente do que ao solvente da amostra [41]. Assim, existem quatro tipos gerais de mecanismos extrativos: fase reversa, fase normal, troca iónica e exclusão molecular [37, 41]. De forma sumária descrevem-se, de seguida, cada um destes mecanismos.
O mecanismo de extração de fase normal envolve uma amostra cuja matriz é apolar ou moderadamente polar e um adsorvente polar. O analito de interesse é polar e a sua retenção deve-se às interações entre os grupos funcionais polares do analito e os grupos polares do adsorvente, nomeadamente ligações de hidrogénio, interações π–π, interações dipolo-dipolo e interações dipolo-dipolo induzido. O analito é eluído com um solvente mais polar do que a própria matriz da amostra [41, 44].
Na troca iónica, se o analito for um composto aniónico (carga negativa), este pode ser separado utilizando um adsorvente com grupos amina quaternários alifáticos. Por outro lado, se o analito for um composto catiónico (carga positiva), a sua separação consegue-se através da utilização de um adsorvente com grupos ácidos sulfónicos alifáticos [41]. Neste caso, o mecanismo de retenção baseia-se principalmente nas atrações eletrostáticas entre os grupos funcionais carregados do analito e os grupos carregados do adsorvente [41, 44].
No mecanismo de exclusão molecular, o adsorvente apresenta uma porosidade uniforme através da qual o composto de interesse se difunde. Assim, os compostos cujo tamanho é
superior ao diâmetro dos poros não ficam retidos no adsorvente, e os que têm tamanho inferior podem penetrar nos mesmos, ficando retidos [45].
Neste trabalho, o mecanismo utilizado foi a fase reversa, a qual envolve uma amostra cuja matriz é polar ou moderadamente polar e um adsorvente não polar. O composto de interesse é normalmente não polar ou moderadamente polar, sendo a sua retenção devida a forças de atração entre as ligações carbono-hidrogénio do analito e dos grupos funcionais que se encontram à superfície do adsorvente. Estas forças de atração são comumente designadas por forças de Van der Walls ou forças de dispersão [41, 44]. O solvente de eluição tem de ser um solvente apolar [41].
Esta técnica extrativa realiza-se em cinco etapas (Figura 4) [44, 46]:
- Acondicionamento, no qual se utiliza um solvente apropriado para facilitar a ativação dos grupos funcionais do adsorvente, permitindo a sua exposição e uma maior interação com o composto de interesse. Esta etapa permite ainda normalizar o ambiente da coluna para a amostra, otimizando assim o contato e a ligação com a amostra. Além disso, removem-se também os interferentes e micropartículas presentes no absorvente.
- Adição da amostra, que consiste na difusão da amostra através do adsorvente por gravidade ou sob vácuo, permitindo a ligação dos compostos de interesse aos grupos funcionais do adsorvente.
- Lavagem, consiste na aplicação de uma série de solventes, geralmente com ordem de polaridade crescente, que não removem o composto de interesse do adsorvente, mas que removem os interferentes da matriz.
- Secagem, que facilita a remoção de componentes aquosos que poderiam contaminar o extrato e prepara o adsorvente para a mudança de fase, quando o solvente de eluição é constituído por solventes orgânicos que são imiscíveis com os solventes de lavagem.
- Eluição, ocorre a quebra da ligação do analito com o adsorvente do cartucho de extração, e os compostos são removidos seletivamente do adsorvente, sendo recolhidos e posteriormente analisados.
Na técnica de SPE, a separação do composto de interesse e dos interferentes presentes na amostra pode ser realizada de três formas diferentes [41, 44]:
- extração seletiva, onde apenas os compostos selecionados se ligam ao adsorvente, não se ligando os interferentes/impurezas;
- lavagem seletiva, em que tanto o composto de interesse como os interferentes são retidos no adsorvente, contudo os interferentes são removidos através de soluções de lavagem suficientemente fortes para os remover, mas fracas o suficiente para não removerem também o composto de interesse;
- eluição seletiva, na qual os compostos de interesse retidos no adsorvente são eluídos num solvente, mas os interferentes permanecem retidos.
A SPE apresenta inúmeras vantagens relativamente a outras técnicas tradicionais de preparação de amostra, como a LLE, tais como: menor tempo de preparação de amostras, elevada recuperação do composto de interesse, concentração eficiente do analito, extratos altamente purificados, capacidade de extrair simultaneamente analitos de uma ampla gama de polaridades, eluição num menor volume de solvente que pode ser evaporado mais rapidamente, compatibilidade com os instrumentos analíticos, e utilização de menores volumes de solventes [41, 43, 46].