Signalisation impliquée dans le phénotype synthétique

Bien que l’expression des protéines CRBP-1 (transporteur du rétinol) et Smemb (une forme embryonnaire de la chaîne lourde de la myosine) aient été identifiées comme spécifiques au phénotype synthétique des VSMC; l’inhibition des voies de signalisation impliquées dans le phénotype contractile semble être le principal mécanisme favorisant la domination du phénotype synthétique (Mack, 2011). Ainsi, plusieurs voies de signalisations peuvent interférer avec les activités de SRF et ses cofacteurs MyoC et MRTF.

En autre, la phosphorylation du domaine de liaison à l’ADN de SRF par les protéines kinases C et A, inhibe l’expression du phénotype contractile. De façon similaire, l’activation des

MAPK ERK1/2 entraîne l’inhibition de MyoC et MTRF [26]. Finalement, l’activation de facteurs de transcription tels que le facteur nucléaire kappa B (NF-κB) ou FOXO4 entraîne la séquestration de MyoC menant à une diminution des différents marqueurs impliqués dans le phénotype contractile des VSMC (Xie et al., 2011).

Hypothèse et objectifs

La contraction cellulaire joue un rôle central dans plusieurs processus physiologiques que ce soit au niveau des cellules musculaires ou non (Kolodney et al., 1999). Ainsi, l’activité mécanique contractile des cellules endothéliales joue un rôle essentiel dans la régulation de la perméabilité vasculaire et cette même activité, chez les VSMC, régule la pression artérielle (Tang et Anfinogenova, 2008). La régulation de la tension cellulaire est donc critique dans l’homéostasie et le fonctionnement du système cardiovasculaire. En effet, il est également établi qu’une contraction anormale des VSMC est souvent associée à l’hypertension et ses complications. L’hypothèse centrale de cette thèse propose que l’étude des mécanismes impliqués dans la transduction de signaux menant à la contraction cellulaire et les mécanismes impliqués dans la régulation de celle-ci pourrait permettre d’identifier de nouvelles cibles potentielles afin d’envisager de nouvelles avenues afin de traiter l’hypertension.

D’ailleurs, certaines découvertes majeures réalisées dans la signalisation reliée aux GPCR ces dix dernières années, principalement dans la signalisation associée aux β-arrestines et le développement d’agonistes biaisés permettant d’étudier cette signalisation, pourraient permettre d’identifier de nouvelles avenues et cibles thérapeutiques pour le traitement de l’hypertension. Toutefois, malgré le rôle important du système angiotensinergique dans l’hypertension (Kim et Iwao, 2000) et la régulation de l’activité contractile des VSMC, la contribution des β-arrestines dans la régulation de la contraction cellulaire induite par l’activation d’AT1aR n’a pas encore été démontrée.

Plusieurs indices suggèrent la participation des β-arrestines dans la régulation de la contraction cellulaire reliée à l’activation d’AT1aR. Il a été montré que la β-arrestine-1 est nécessaire à l’activation de Rho A et de son effecteur ROCK dans la formation des fibres de stress (Barnes et al., 2005). Il a été montré récemment l’importance de β-arrestine-1 et 2 dans la régulation du bourgeonnement cellulaire induit par Rho A (Godin et Ferguson, 2010). Il a également été montré que la β-arrestine-2 était nécessaire dans la chimiotaxie induite par l’Ang II chez les cellules HEK 293 surexprimant le récepteur AT1aR (AT1aR-293) (Hunton

et al., 2005). Finalement, puisque la sous-unité régulatrice de MLCP, MYPT-1, interagit avec la β-arrestine-2 suivant l’activation du récepteur AT1a (Xiao et al., 2007) ; nous avons émis l’hypothèse que les β-arrestines régulent la phosphorylation de la MLC et la contraction cellulaire. Ainsi le premier objectif de cette thèse sera de déterminer les rôles respectifs de la β-arrestine-1 et 2 dans la régulation de la phosphorylation de la MLC et l’impact de cette régulation sur la contraction cellulaire.

Tel que mentionné précédemment, une dérégulation de l’état contractile ou de la capacité intrinsèque des VSMC à se contracter peut mener à l’hypertension et ses diverses conséquences (de Gasparo et al., 2000). D’ailleurs, en conditions diabétiques où la formation des AGE est augmentée, il a été observé que les VSMC subiraient un revirement phénotypique du type contractile vers un type sécrétoire/synthétique (Etienne et al., 1998; Pandolfi et al., 2003). Toutefois, les mécanismes responsables de ces changements causés par l’hyperglycémie chronique rencontrée en condition diabétique et l’impact de ces derniers sur la fonction contractile des VSMC demeurent à être déterminés.

Il est connu que l’activation de RAGE par les AGE induit plusieurs voies de signalisation dont celles des MAPK ERK 1/2 qui favorise l’augmentation de l’activité transcriptionnelle de NF-κB (Goldin et al., 2006; Hall, 1998; Taguchi et al., 2000). Or, en plus d’être impliqué dans la transcription du plusieurs gènes inflammatoires (Yan et al., 1994), NF-κB régule négativement l’expression des protéines impliquées dans le phénotype contractile des VSMC (Xie et al., 2011). Il est intéressant de mentionner les travaux de Suga et al. (Suga et al., 2011), qui, dans un modèle de VSMC exposé aux AGE et surexprimant de façon transitoire RAGE, montraient que les VSMC semblaient acquérir des propriétés s’apparentant aux ostéoblastes; suggérant un rôle des AGE dans la calcification vasculaire en condition diabétique. Toutefois, à ce jour, il existe peu d’informations sur les effets fonctionnels au niveau des VSMC de l’activation de RAGE endogène. Ainsi, nous avons émis l’hypothèse que l’activation de RAGE endogène nuit à l’expression du phénotype contractile des VSMC et interfère avec leur fonction. Ainsi, le second objectif de cette thèse sera de déterminer les effets de l’activation de RAGE sur le phénotype, les propriétés mécaniques des VSMC

et diverses fonctions cellulaires telles que la signalisation, la contraction et l’organisation du cytosquelette.

Objectif #1 (Article 1)

Afin de déterminer les rôles respectifs des β-arrestine-1 et 2 dans la régulation de la phosphorylation de la MLC et l’impact de cette régulation sur la contraction cellulaire, l’interaction entre la β-arrestine-1 et des éléments de régulation de la contraction cellulaire a été déterminée en effectuant un criblage double hybride en levure. Ensuite, les rôles respectifs des β-arrestine-1 et 2 dans la régulation de la phosphorylation de la MLC ont été évalués par immunobuvardage en interférant avec l’expression de l’une ou l’autre des β-arrestines en utilisant de petits ARN interférents. Les conséquences fonctionnelles de cette régulation par les β-arrestines ont également été identifiées en mesurant la contraction cellulaire induite par l’activation d’AT1aR par microscopie à force atomique (AFM). De plus, l’importance des β- arrestines et de la signalisation biaisée dans le contraction cellulaire a été confirmée en utilisant le [Sar1_,Ile4_,Ile8_{]-Ang, un agoniste du récepteur AT1aR n’activant que la voie}

dépendante des des β-arrestines. Ainsi, la contraction cellulaire induite par cet agoniste a été mesurée en utilisant l’AFM. Également, le rôle des β-arrestines dans la signalisation associée à ce ligand biaisé a été confirmé en mesurant la contraction cellulaire par AFM chez les cellules où l’expression de l’une et/ou l’autre des β-arrestines a été interférée par petits ARN interférents. Finalement, l’importance des β-arrestines dans la migration cellulaire a été montrée dans un modèle de VSMC, afin de confirmer la contribution et l’impact fonctionnel de la signalisation biaisée dans la contraction cellulaire.

Objectif #2 (Article 2)

Afin de déterminer les effets de l’activation de RAGE sur le phénotype, les propriétés mécaniques des VSMC et diverses fonctions cellulaires telles que la signalisation, la contraction et l’organisation du cytosquelette, deux types des AGE ont été synthétisés à partir d’albumine sérique recombinante humaine. Puis, la présence du récepteur RAGE dans le

modèle de VSMC, soit les cellules A7r5, a été validée. Afin de confirmer la fonctionnalité de RAGE, l’activité de plusieurs voies de signalisation (ERK, JNK, p38, AKT) et du facteur de transcription (NF-κB) a été mesurée respectivement par immunobuvardage et epifluorescence dépendante d’un système de gène rapporteur NF-κB/GFP. Ensuite, l’impact de cette signalisation a été évalué sur la transcription (qPCR) et l’expression protéique (immunobuvardage) de plusieurs marqueurs reliés au phénotype contractile des VSMC (SM- α-actin, SM-MHC, MyoC, SM-22α). Les effets de l’activation de RAGE sur le phénotype cellulaire ont également été déterminés, en s’intéressant aux changements engendrés sur propriétés mécaniques cellulaires. Les changements morphologiques et dans l’organisation du cytosquelette ont été observés par microscopie traditionnelle, alors que la rigidité ainsi que la hauteur de cellule par AFM. L’activité de la myosine a été observée quant à elle via la mesure de la phosphorylation de sa chaîne légère (MLC) par immunobuvardage. Finalement, l’impact des changements du phénotype cellulaire induit par l’activation de RAGE ont été déterminés sur diverses fonctions cellulaires impliquant la signalisation calcique (Fura2- AM), les changements morphologiques (immunofluorescence du cytosquelette d’actine), l’activation de la myosine (phosphorylation de la MLC par immunobuvardage) et la génération de forces mécaniques (AFM) suite à la stimulation cellulaire, via l’activation du récepteur V1 de l’AVP.

2MATÉRIEL ET MÉTHODES