Pour évaluer l’efficacité de cette sonde à modifier de façon covalente une MMP et démontrer que le site de cette modification ne concerne que le site actif des MMP, nous avons choisi d’étudier en premier lieu le domaine catalytique de la MMP-12 humaine. Ce choix s’est essentiellement effectué sur un critère de disponibilité de cette enzyme. Afin de démontrer l’existence d’une modification covalente de la hMMP-12 par notre sonde, le protocole mis en place, après photoactivation du complexe hMMP-12/sonde, comporte les étapes suivantes : 1° l’isolement du complexe covalent par migration de ce complexe dans un gel d’électrophorèse, en conditions dénaturantes (SDS-PAGE) ;
2° le transfert des protéines contenues dans le gel sur une membrane fine en nylon de type PVDF ;
3° une détection et une quantification des protéines radioactives transférées sur la membrane, à l’aide d’un radioimageur Biospace.
Ce protocole suppose que les complexes hMMP-12/sonde, non-covalents, soient effectivement dissociés lors de l’étape de dénaturation des protéines avant migration sur gel, permettant ainsi d’attribuer à l’observation de bandes de radioactivité la présence univoque de complexes covalents. Cette séparation par un gel d’électrophorèse devrait aussi permettre d’éliminer les formes libres de l’inhibiteur radioactif, formes qui sont toujours en excès par rapport à la cible dans les conditions de saturation de celle-ci.
Après incubation de la sonde en présence de hMMP-12, puis photoactivation de la sonde, le protocole d’analyse décrit ci-dessus permet de mettre en évidence une bande de radioactivité, dont la position sur le gel s’accorde avec le poids moléculaire de la hMMP-12. De façon importante, l’expérience contrôle, en
pour une détection sensible des MMP
absence de photoactivation, ne révèle aucune présence de radioactivité. Ce résultat démontre que le signal de radioactivité, observé sur la membrane de PVDF, implique la modification covalente de la hMMP-12 (figure 2.2.A).
a) Site de modification covalente
Pour démontrer que le site de la modification de la hMMP-12 par notre sonde ne concerne que le site actif de l’enzyme, la même expérience que celle décrite ci-dessus a été réalisée en ajoutant au préalable un compétiteur non photoactivable et non radioactif, le composé 1, que nous avons défini précédemment comme étant un inhibiteur de type phosphinique capable d’interagir à haute affinité avec le site actif de la MMP-12. La constante d’inhibition Ki pour la hMMP-12 de ce composé est la suivante : KiB(hMMP-12)B = 0.4
nM.
En présence de ce compétiteur en excès ([composé 1] = 5*[sonde]), seule une très faible bande de radioactivité est observée, ce qui permet de conclure que le site de modification de notre sonde ne concerne effectivement que le site actif de la hMMP-12 (figure 2.2.A).
U
Figure 2.2 :U Modification covalente de la hMMP-12 par la sonde photoactivable, composé 2.
50 ng hMMP-12 ont été incubés en présence de 2 μM de composé 2 pendant 10 min, en absence et en présence de 11 μM de composé 1, avant 2 min d’irradiation UV ; pour les expériences contrôles les complexes hMMP-12/sonde, en absence de compétiteur, n’ont pas été photoactivés. Les complexes photoactivés ou non ont été séparés par SDS-PAGE 12%, puis :
A, les protéines, présentes dans le gel d’électrophorèse, ont été transférées sur une membrane de PVDF pour une lecture de radioactivité au β-imager ;
pour une détection sensible des MMP b) Rendement de modification covalente
Il est intéressant de noter que la coloration au nitrate d’argent d’un gel SDS-PAGE, sur lequel a été chargée la hMMP-12 photoirradiée en présence de la sonde (figure 2.2.B), révèle deux bandes de poids moléculaires distinctes, alors qu’une seule bande est révélée lorsque l’on fait migrer la hMMP-12 non- photoirrradiée. La comparaison de ces résultats avec ceux obtenus pour les mêmes échantillons analysés par le ß-imager montre que la bande supérieure, de plus haut poids moléculaire, visualisée en coloration au nitrate d’argent, représente la hMMP-12 modifiée par la sonde azoture, alors que la bande inférieure, de plus bas poids moléculaire et non radioactive, correspond à la hMMP-12 non modifiée. L’expérience de compétition analysée par coloration au nitrate d’argent confirme cette interprétation, puisque dans ces conditions une seule bande, celle de plus bas poids moléculaire, est visualisée. Ces observations donnent accès à un moyen de calcul simple du pourcentage de modification covalente de la hMMP-12 par la sonde. Ce paramètre peut être facilement déterminé en calculant le rapport des intensités de ces deux bandes révélées par coloration au nitrate d’argent (logiciel Biorad : Quantity-One®). Cette approche permet d’estimer un pourcentage de modification covalente de la hMMP-12 par notre sonde de l’ordre de 42±5 %, un excellent résultat laissant présager une très bonne sensibilité de détection des formes actives de MMP-12 par cette sonde.
c) Seuil de détection
Afin de déterminer le seuil de détection de formes actives de hMMP-12 pouvant être atteint par notre sonde, différentes quantités de hMMP-12 (1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01 et 0.005 ng) ont été incubées en présence d’une quantité constante de sonde (2 µM). Comme le montre la figure 2.3, après migration sur gel et analyse des membranes au β-imager, 50 pg de hMMP-12 peuvent être
pour une détection sensible des MMP
détectés grâce à cette sonde, soit un seuil de détection de 2.5 femtomoles de hMMP-12 (une concentration de 100 pM de hMMP-12).