4.3.1.1 Inibição da atividade catalítica da cruzaína
A série (43a–t) foi planejada através do uso do grupamento fenóximetilcetona, previamente descrito numa classe de inibidores potentes da cruzaína95 em combinação com o grupamento 2-iminotiazolidina-4-onas (38) previamente explorada pelo nosso grupo de pesquisas. A partir deste planejamento, seguido pela combinação de substituíntes
localizados nas posições N3 e C5 resultaram na composição dos compostos (43a–r). Por último, a troca bioisostérica da carbonila pela tiocarbonila levou a preparação dos compostos (43s) e (43t).
A figura 27 apresenta os dados de inibição da atividade catalítica da cruzaína do T. cruzi. O protocolo experimental descrito por Ferreira e col.116 foi utilizado neste ensaio com a enzima. Inicialmente, todos os compostos foram testados na concentração de 20 ou 100 µM. Os compostos que inibiram 50 % da atividade enzimática foram selecionados para determinação dos valores de CI50.
Figura 27: Inibição da enzima cruzaína do T. cruzi. Valores de CI50 (µM) (±desvio padrão) calculados após 10
minutos de incubação com a enzima. Inativo significa que o composto não inibiu a enzima na concentração de 100 µM. Valores de CI50 representam experimentos em triplicatas.
Podemos iniciar a análise das REA comparando os compostos com substituíntes inseridos nas posições N3 e C5 no anel tiazolidínico (43b–r) em comparação com o composto não substituído (43a).
Nós percebemos que modificações na posição N3 afetam as propriedades inibitórias das 2-iminotiazolidina-4-onas na cruzaína muito mais do que modificações realizadas na
posição C5. Por exemplo, os compostos com o NH livre (43a–e) não inibiram a cruzaína quando comparado com os compostos (43k–o), que possuem uma fenila na posição N3. Os compostos (43f–j), que possuem uma metila na posição N3, não apresentaram propriedades inibitórias frente a cruzaína, com exceção do composto (43i), que apresentou CI50 = 8.0±0.1 µM.
Os compostos (43k–n) possuem um anel fenilíco em N3 e exibiram propriedades inibitórias pronunciadas na cruzaína. Os compostos (43k–m) possuem propriedades inibitorias na cruzaína nas mesmas ordens de magnitude. Estes resultados são indicativos que a inserção de uma metila (43l) ou etila (43m) não aumenta a inibição da atividade catalítica na cruzaína quando comparado com o composto não substituído (43k). Mas isto muda quando uma isopropila ou fenila são inseridos na posição C5. O composto (43n), que possui um substituínte isopropil (43n), apresentou CI50 = 6.6±0.1 µM, sendo duas vezes
mais potente do que o composto (43k) e o mais potente de toda a série (43b–r). Ao contrário dos compostos (43m, etil) e (43n, isopropil), que inibiram significantemente a cruzaína, o composto com uma fenila em C5 (43o) não apresentou propriedade inibitória.
Os resultados com os compostos (43k–o) sugerem que grupos alifáticos (etil ou isopropil) na posição C5 do anel tiazolidínico são benéficos para inibir a cruzaína, mas não um substituínte fenilíco.
Após identificarmos que a fenila na posição N3 como sendo a melhor modificação estrutural para conferir propriedades inibitórias frente a cruzaína, nós vislumbramos a substituição da fenila por outros grupo. Devido a facilidade em preparar o composto (43m), nós decidimos usá-lo como protótipo-estrutural. Estas modificações levaram aos compostos (43p–r).
Ao analisar a inibição na cruzaína pelos compostos (43p–r) em comparação com o protótipo (43m), podemos observar algumas relações estruturais interessantes (figura 28).
Figura 28: Inibição da enzima cruzaína do T. cruzi. Valores de CI50 (µM) (±desvio padrão) calculados após 10
A troca do substituínte fenil (43m) pelo 4-metilfenil (43p) ou 4-metóxifenil (43q) não alterou a inibição da atividade catalitica na cruzaína, sendo estes compostos equipotentes. Porém, a troca da fenila (43m) pelo substituínte ciclohexil (43r) não foi benéfico, sendo o composto (43r) destituído de afinidade pela enzima cruzaína (CI50 > 20 µM).
Após a determinação da inibição da atividade catalítica na cruzaína pelos compostos (43a–r), podemos inferir uma visão geral sobre o efeito dos substituíntes inseridos nas posições N3 e C5 no anel tiazolidínico. Por um lado, substituíntes alifáticos na posição N3, tais como metila ou ciclohexila, não são bem acomodados no sítio catalítico da enzima cruzaína, enquanto que um anel aromatico é bem acomodado. Por outro lado, os melhores substituíntes na posição C5 foram etil (43m) e isopropil (43d, 43i, 43n), enquanto que uma fenila (43j, 43o) nesta posição não é benéfico para a atividade.
Uma vez que nós investigamos as modificações estruturais nas posições N3 e C5, nós decidimos explorar a modificação estrutural na carbonila. Para isto, a troca da carbonila (43c, 43o) pela tiocarbonila (43s, 43t) foi efetuada (tabela 2). Os compostos (43c, 43o) foram selecionados como precursores para a síntese dos compostos tiocarbonilados (43s,
43t), pois estes dois compostos apresentaram atividade tripanocida baixa, além de serem
inativos frenta a cruzaína. Para ter uma visão mais geral sobre os efeitos esteroeletrônicos da carbonila versus tiocarbonila, nós decidimos avaliar a atividade inibitória na cruzaína pelas tiossemicarbazonas (48a, 48c) e semicarbazona (51).
O composto tiocarbonilado (43t) com CI50 = 7.0±0.4 µM, enquanto que seu análogo
carbonilado (43o) na concentração de 100 µM inibiu 43±2.0 % da atividade catalítica da cruzaína na concentração de 20 µM (CI50 >20 µM). A mesma relação é observada na
comparação entre os compostos (43o) e (43t). Portanto, a troca da carbonila pela tiocarbonila melhora a atividade inibitória na cruzaína para as 2-iminotiazolidina-4-onas.
As tiossemicarbazonas (48a) e (48c) apresentaram inibição potente frente à cruzaína, com valores de CI50 na faixa de 0.3–0.5 µM. Já a semicarbazona (51) não
apresentou atividade inibitória na cruzaína. Os valores de CI50 que observamos para as
tiossemicarbazonas (48a) e (48c) são consistentes com os dados na literatura, que descrevem tiossemicarbazonas como inibidores da cruzaína com valores de CI50 em
concentrações na faixa de 0.01–0.001 µM, enquanto que semicarbazonas são destituídas de propriedades inibitórias na cruzaína.88,89
Tabela 2: Inibição da atividade catalítica na cruzaína pelos compostos carbonilados (43c, 43o) versus
tiocarbonilados (43s, 43t).
Compostos % de inibição da cruzaína
(compostos 20 µM)[a],[b] CI50 ±DP (µM) na cruzaína[a],[c] 0 ND[d] - 0.28±0.01 - 0.51±0.001 0 ND 48±1.0 18.7±2.0 43±2.0 > 20 72±5.0 7.0±0.4 [a]
Após 10 minutos de incubação com a enzima cruzaína. [b]Cada composto foi testado na concentração de 20 µM, em triplicata. [c]Valores estimados usando ao menos oito concentrações diferentes. ND, não determinado.
As 2-iminotiazolidina-4-tionas (43s, 43t) e as tiossemicarbazonas (48a, 48c) têm em