Les scnRNA

La plupart des protozoaires ciliés, comme Tetrahymena thermophila, sont caractérisés par un dichroïsme nucléaire. Chaque cellule de Tetrahymena contient un macronoyau (Mac) et un micronoyau (Mic). Le Mac est polyploïde et transcriptionnellement actif alors que le Mic est diploïde et transcriptionnellement inerte dans les cellules végétatives. Pendant la conjugaison,

Fig. 51 : Rôle des scnRNA dans l'élimination des IES chez Tetrahymena.

Mic : Micronoyau ; Mac : Macronoyau.

le Mic effectue une méiose pour former deux pronoyaux haploïdes dont un est échangé avec l'autre cellule conjugante. Les pronoyaux "migrateur" et "stationnaire" fusionnent alors créant un noyau zygotique qui se divise pour produire les nouveaux Mic et Mac. Suite à la formation du nouveau Mac, l'ancien Mac est résorbé. Pendant son développement, le nouveau Mac subit de nombreux réarrangements entraînant une élimination d'environ 15% du génome micronucléaire. Deux types de séquences sont éliminées. Les séquences BES (Breakage-Eliminated Sequence) se composent de régions relativement courtes (< 50 pb) flanquées de régions conservées de 15 pb permettant la coupure du chromosome. Des séquences télomériques sont alors ajoutées au niveau de ces coupures. L'élimination du deuxième type de séquence, appelé IES (Internal-Eliminated Sequence) et dont la taille varie de 0,5 à 20 kb, est suivie d'une "religation" des séquences destinées au Mac (MDS).

Pendant plusieurs années, le mécanisme d'élimination d'ADN au cours de la différenciation du du nouveau Mac est resté énigmatique. Le rôle de l'interférence ARN dans ce mécanisme a récemment été mis en évidence. Pendant la conjugaison, le génome micronucléaire est transcrit sur les deux brins permettant la formation de dsRNA qui sont alors digérés par un processus similaire à l'interférence ARN pour former des scanRNA ou scnRNA d'une taille d'environ 28nt (étape 1 Fig. 51). Les dsRNA ou leurs produits de digestion seraient alors transférés en association avec une protéine à chromodomaines, appelée Pdd1p, dans le cytoplasme (étape 2 Fig. 51) puis dans le Mac parental où ils s'accumulent pendant les stades précoces de la conjugaison. Les scnRNA s'associent ensuite aux séquences homologues de l'ancien Mac qui sont dégradées (étape 3 Fig. 51). Ainsi, seuls les scnRNA homologues aux séquences spécifiques du Mic subsistent et sont transférés dans le nouveau Mac où ils ciblent spécifiquement les IES et BES afin de les éliminer (étape 4 Fig. 51). Lors de cette dernière étape, les scnRNA s'associent avec les protéines à chromodomaines Pdd1p et Pdd3p ainsi qu'avec une protéine de la famille Argonaute possédant les domaines PAZ et PIWI, nommée Twi1p. Cette dernière est essentielle à l'accumulation des scnRNA pendant la conjugaison ainsi qu'à l'élimination des IES et BES. D'autre part, un "knock-out" des gènes PDD1 et TWI1 provoque une altération de la méthylation H3K9 au niveau des IES qui est également une caractéristique de l'hétérochromatine chez Tetrahymena. L'élimination des IES est également affectée lors d'une mutation de la lysine 9 en glutamine dans les histones H3 en dépit d'une accumulation normale des scnRNA. Ainsi la méthylation H3K9 est essentielle à l'élimination des IES. Mochizuki et Gorovsky (2004) ont proposé que lors de leur entrée dans le nouveau Mac, les scnRNA s'associent avec Twi1p et reconnaissent de façon séquence-spécifique les

Fig. 52 : Comparaison entre les réarrangements du génome chez T. thermophila et la formation de l'hétérochromatine chez S. pombe et A. thaliana.

Les lignes en pointillé représentent les IES ou les séquences hétérochromatiques. Les lignes pleines représentent les MDS ou séquences non-hétérochromatiques. Les lignes rouges courbées représentent l'ARN.

IES. Les protéines à chromodomaines Pdd1p et Pdd3p ainsi que des méthyltransférases spécifiques des H3K9 seraient alors activées et permettraient la formation de l'hétérochromatine dans ces régions. Ce mécanisme semble apparenté au processus d'hétéochromatinisation médié par les rasiRNA chez S. pombe et A. thaliana. Cependant, chez les ciliés, les structures présentant une conformation d'hétérochromatine sont éliminées alors que chez S. pombe et A. thaliana elles sont maintenues sous une forme transcriptionnellement inactive (Fig. 52).

Le génome de Tetrahymena code pour trois protéines apparentées à Dicer (Dcr1p, Dcr2p et Dcl1p). Mochizuki et Gorovsky (2005) ont montré que la protéine Dcl1p est nécessaire à l'élimination des IES. Elle est requise pour l'accumulation de scnRNA, la digestion des transcrits de longue taille du génome micronucléaire ainsi que pour la méthylation des H3K9. Cette protéine aurait également un rôle dans la ségrégation des chromosomes micronucléaires lors des divisions mitotiques et méiotiques.

Nous savons par ailleurs que l'injection de dsRNA homologues à des MDS induit l'élimination de ces séquences pendant la conjugaison. Ce résultat confirme donc l'existence d'un mécanisme apparenté à l'interférence ARN entraînant une élimination d'ADN chez

Tetrahymena. De la même façon, un transgène d'origine bactérienne inséré dans le génome de Tetrahymena est éliminé lors de la conjugaison. Ainsi, un mécanisme de surveillance du

génome contre l'invasion de séquences étrangères, comme des transposons, est opérationnel chez Tetrahymena. Ces résultats ont récemment été confirmés par Liu et al. (2005). Ces auteurs ont montré que l'élimination des séquences étrangères se ferait par un mécanisme similaire à l'élimination des IES endogènes et que son efficacité augmente avec la nombre de copies de transgènes insérés dans le génome.

Chez la paramécie, la transformation du Mac avec une forte quantité de transgènes homologues à un gène endogène entraîne la délétion de ce gène à la suite d'une autogamie (remplacement du Mac à partir du Mic dans une cellule unique). Une délétion séquence-spécifique est également observée dans des cellules ayant subi une autogamie à la suite de l'ingestion de bactéries produisant des dsRNA homologues à un gène endogène (Garnier et al., 2004). Ce phénomène est corrélé à l'accumulation d'ARN de 22 à 23nt se distinguant des scnRNA de Tetrahymena non-seulement par leur taille mais aussi par le fait qu'ils ne sont pas régulés au cours du développement. Ces ARN sont produits par le transgène macronucléaire

dans la cellule végétative et leur quantité ainsi que leur mobilité ne varient pas pendant l'autogamie. Les ARN de 22 à 23nt cibleraient la dégradation d'un ARNm homologue avant la méiose et seraient à l'origine du mécanisme d'interaction ARN-ARN. Lors du développement du Mac chez la paramécie, les scnRNA homologues aux séquences macronucléaires s'associeraient aux transcrits du Mac parental, plutôt qu'à l'ADN, empêchant leur transfert dans le nouveau Mac. Les ARN de 22 à 23nt produits par le transgène dégraderaient alors les transcrits du Mac permettant aux scnRNA homologues de cibler les délétions de façon séquence-spécifique dans le nouveau Mac.

IV. L'interférence ARN : un outil d'analyse fonctionnelle