Adaptation de la méthode DDI sur une surface d’or
6.2. Les SAM (Self Assembled Monolayers)
6.2.1. Qu’est-ce qu’une SAM
Les SAM sont des couches auto-organisées de molécules. Dans le cas des biocapteurs, cette couche doit créer le lien entre la surface du transducteur (or) et la biomolécule à immobiliser. En général ce sont des molécules organiques qui présentent une fonction chimique différente à chacune de leurs extrémités (Figure 6-1). L’une doit présenter une forte affinité pour la surface d’or (formation de la liaison S-Au par chimisorption dans notre cas) et l’autre doit comporter un groupement fonctionnel permettant de greffer une molécule biologique (un acide carboxylique qui va pouvoir réagir avec une amine de la protéine par exemple pour former une liaison amide).
Figure 6-1 Représentation de la liaison or-thiol
Des surfaces homogènes peuvent être réalisées par auto-assemblage de monocouches organiques (Figure 6-2). L’auto-assemblage, ou formation spontanée de structures hiérarchiques complexes à partir de briques simples, est un phénomène omniprésent dans la nature. Il gouverne la formation des parois cellulaires ainsi que le repliement des protéines. Lorsque ce processus se produit à l’interface solide/liquide, par adsorption de molécules tensioactives à partir d’une solution, il donne lieu à des assemblages moléculaires bidimensionnels qui peuvent être très ordonnés (Love et al. 2005; Wink et al. 1997).
Au O OH S O OH S queue groupe de tête groupe fonctionnel
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Figure 6-2 Représentation d’une SAM. En jaune sont représentées les molécules d’or, en rouge les molécules de soufre, en noir le carbone et en blanc les hydrogènes
Les thiols (composés organiques comportant un groupement thiol : -SH attaché à un atome de carbone) sont structuralement similaires aux alcools mais leurs propriétés chimiques sont différentes. Les thiols sont plus nucléophiles, plus acides et plus facilement oxydés. La différence d’électronégativité entre l’atome de soufre (2,58) et l’atome d’hydrogène (2,20) est petite ce qui empêche toute liaison hydrogène de se former. En infrarouge, les thiols sont remarquables par l’existence d’une bande assez faible vers 2560 cm-1
.
Les composés organosulfurés tels les alcanethiols ont une très forte affinité avec différents métaux (or, argent, platine ou cuivre). Par exemple, l'énergie de la liaison Au-S est de l’ordre de 100 kJ.mol-1
. Il est important de noter que cette liaison est réversible. Néanmoins l’énergie des liaisons S–S, suivant les cas, est comprise entre 265 et 430 kJ·mol-1
il est donc nécessaire de faire attention à la formation des ponts disulfures. D’autre part, la structure de la SAM dépend de la morphologie du métal et de sa cristallinité. L’or Au(111) est le plus couramment utilisé car il est inerte et, de plus, les films déposés sur l’or adoptent cette orientation cristallographique (Wink et al. 1997).
Les thiols peuvent être adsorbés directement sur la surface d’or grâce à des solvants de haute pureté (éthanol absolu ou eau en fonction de la polarité des alkanethiols utilisés). La formation de la SAM se passe en deux temps : le temps d’adsorption et le temps d’organisation des molécules à la surface. Le temps d’adsorption semble être indépendant de la longueur de la chaine. Néanmoins, le temps d’organisation de la SAM est diminué lors de l’utilisation de solutions concentrées. Une solution diluée d’alkanethiols peut former une monocouche dense en moins d’une heure (Wink et al. 1997).
6.2.2. SAM simple
La SAM simple consiste en l’auto-organisation, sur une surface métallique, d’une monocouche d’un seul type de thiol. A la Figure 6-3 se trouve un exemple de SAM simple avec le thiol noté thiol 2 dans le chapitre 2 : HS-C11-EG3-COOH. Le groupement fonctionnel est un acide carboxylique pouvant réagir avec une amine pour former une liaison amide.
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Figure 6-3 Représentation d’une SAM simple sur or avec le thiol HS-C11-EG3-COOH
6.2.3. SAM mixte
La SAM mixte consiste en l’organisation, sur une surface métallique, d’une monocouche auto-assemblée de deux types de thiol. Souvent un thiol possédant le groupe fonctionnel désiré et l’autre thiol utilisé en tant qu’agent intercalant et/ou permettant d’éviter les adsorptions non spécifiques grâce à des groupements éthylène glycol (EG) par exemple. A la Figure 6-4 se trouve un exemple de SAM mixte avec les thiols notés thiol 2 et 4 dans le chapitre 2 : HS-C11-EG3-COOH et HS-C11-EG3-OMe. Le groupement terminal –OMe ne réagira pas avec l’amine mais ce dernier s’intercale entre les groupements fonctionnels acide carboxylique afin de les éloigner les uns des autres et de les rendre plus accessibles.
Figure 6-4 Représentation d’une SAM mixte sur or avec les thiols HS-C11-EG3-COOH et HS-C11-EG3-OMe
L’or nu permet un auto-assemblage de molécules pourvues de fonctions thiols. Le choix d’une telle surface entraine la détection d’un grand nombre d’interactions non spécifiques résultant de l’adsorption des analytes sur le support métallique. Une étape de passivation de la surface avec une solution de mercaptoethanol est donc indispensable pour réduire ce phénomène (Rella et al. 2004).
6-- 171 - Plusieurs publications présentent des protocoles de greffages différents. L’équipe de Li et al utilise un mélange éthanol/eau pour la formation des OEG-SAMs ce qui permet d’obtenir une plus forte densité de SAMs sur la surface d’or par rapport à l’utilisation d’une solution d’éthanol pure (Li et al. 2005). Dhayal et al ainsi que pour Briand et al, ont joué sur la longueur des chaines thiols pour augmenter l’accessibilité de la cible sur la sonde (Briand et al. 2006; Dhayal and Ratner 2009). Plusieurs revues de la littérature récapitulent l’ensemble des techniques d’immobilisation (Homola et al. 1999; Love et al. 2005; Samanta and Sarkar 2010; Wink et al. 1997). Toutefois, nous nous sommes focalisés sur la formation de SAM adaptée pour réaliser une immobilisation par DDI.
Concernant la densité de surface, ajouter du MgCl2 à la solution de spotting permet de limiter les répulsions électrostatiques de l’ossature phosphatée de l’ADN et ainsi, d’obtenir une densité de sondes suffisamment élevée d’après Kick et al (Kick et al. 2010).
Ainsi, nous avons débuté ce travail par l’étude de l’effet du prétraitement sur la formation d’une SAM. Puis nous avons testé la formation de plusieurs SAM : SAM simples, SAM mixtes et analysé les surfaces à l’issu de chaque fonctionnalisation afin de déterminer la fonctionnalisation chimique optimale. Enfin nous avons testé l’immobilisation d’un simple brin d’ADN sur la surface afin de préparer le biocapteur à une immobilisation dirigée par l’ADN (DDI).