Neste estudo foram utilizados três “tipos” de V. destructor para infestar artificialmente alvéolos de criação operculada de obreira. A metodologia adoptada no presente estudo foi idêntica à utilizada por Boecking e Drescher (1991, 1992), Guerra et al. (2000) e Flores et al. (2001, 2003). Dois quadros com criação operculada de obreira de cada uma das 12 colónias foram individualmente marcados. A criação utilizada encontrava-se no estado de pupa de 7 dias após a operculação [pupas brancas com olhos pigmentados (vermelho acastanhado) (Rembold et al., 1980)].
No sentido de estimar a idade da criação (e para possibilitar a sua posterior localização), marcava-se, numa folha de acetato, os alvéolos de criação que tinham sido operculados à menos de 24 horas.
Os ácaros utilizados na infestação artificial de alvéolos foram recolhidos de criação recém-operculada de obreira oriunda de colmeias dadoras, altamente parasitadas por V. destructor, mantidas a mais de 5 Km do apiário experimental. O estado reprodutivo dos ácaros no momento da recolha e da introdução era desconhecido. Na infestação artificial de alvéolos apenas foram introduzidos ácaros totalmente pigmentados.
As V. destructor foram introduzidas nos alvéolos através de uma pequena abertura na parte lateral do opérculo efectuada com um bisturi (Ruijter, 1987; Boecking e Ritter, 1993; Janmaat e Winston, 2000), como se mostra na Figura 4.1 a e b. Cada alvéolo foi infestado com três ácaros e cuidadosamente fechado. Foram utilizadas 3 varroas mortas e os alvéolos de criação foram observados após 24 horas de infestação, uma vez que, Flores et al. (2001) comprovaram que as obreiras reagiam de forma clara, no período de 24 horas, a este número de varroas.
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a b
Figura 4.1. Marcação de alvéolos e corte lateral do opérculo (a) e introdução de ácaros (b)
Neste estudo, utilizaram-se três tipos diferentes de V. destructor. Varroas mortas por congelação, varroas mortas naturalmente e varroas vivas. Estas três “fontes de variação”, que determinam três “tratamentos” diferentes neste estudo, serão por conveniência de linguagem, designados por “métodos”.
Assim, o primeiro método consistiu na infestação de alvéolos de criação com três ácaros mortos por congelação (AMC). O processo de morte consistiu na congelação dos ácaros a -20º durante 48 horas. Estes ácaros foram posteriormente descongelados durante cerca de duas a três horas antes da sua introdução nos alvéolos de criação.
O segundo método (AMN) consistiu na infestação de alvéolos com três ácaros mortos naturalmente. Estes, após a sua recolha foram colocados em placas de petri, permanecendo a temperatura ambiente até perecerem.
O terceiro método (AV) consistiu na infestação de alvéolos com três ácaros vivos. Os ácaros vivos, recolhidos de alvéolos de criação de obreira, foram mantidos incubados sobre pupas de obreira (34ºC) durante as 24 a 48 horas que precederam à sua transferência para os alvéolos a infestar artificialmente.
Assim, utilizaram-se doze colónias. Em três colónias estudou-se a resposta a AMC, em três outras a resposta a AMN e em três outras, a resposta a AV. Nas restantes 3 colónias foram aplicados conjuntamente os três métodos, neste caso identificados pelo acrescento do índice c (AMCc, AMNc e AVc). Cada um dos métodos de infestação foi aplicado em 2 quadros por colmeia. Em cada quadro foram utilizados 3 grupos de 10 alvéolos com criação operculada de obreira. No primeiro grupo foram introduzidos os ácaros. No segundo grupo (Test. I) os alvéolos foram abertos e fechados sem introduzir
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grupo, sem qualquer manipulação, visou monitorizar o possível canibalismo das abelhas durante o período experimental, tal como descrito por Boecking e Ritter (1993). Estes grupos foram marcados em folhas de acetato, seguindo a metodologia de Ifantidis (1983). Depois de manipulados os quadros foram recolocados nas suas respectivas posições e colmeias. A resposta comportamental das abelhas foi avaliada 24 horas após a infestação com ácaros mortos e 240 horas após a infestação com ácaros vivos.
A inspecção microscópica dos opérculos (lupa binocular, Leica MZ 12.5) dos alvéolos que não foram removidos pelas abelhas permitiu verificar se estas abriram, examinaram e construíram novos opérculos (Boecking e Spivak, 1999).
Paralelamente, a inspecção dos alvéolos que não foram removidos permitiu verificar se as abelhas abriram, libertaram e/ou removeram os ácaros ou, e alternativamente, se estes permaneciam sobre a criação. Assim, cada alvéolo de criação operculada aparentemente intacto foi aberto, a pupa removida com a ajuda de uma pinça, e as paredes dos alvéolos foram cuidadosamente examinadas para verificar a presença dos ácaros introduzidos artificialmente.
O nível de comportamento higiénico foi avaliado através do registo da percentagem alvéolos de criação manipulados pelas abelhas.
Nos resultados avaliaram-se dois comportamentos (I e II): comportamento I as abelhas limparam completamente os alvéolos parasitados, retirando os parasitas e as pupas de obreira. No comportamento II as abelhas desopercularam e reopercularam os alvéolos, retirando um ou mais V. destructor (no caso do ácaro não ter abandonado os alvéolos) mas não a criação de obreira que estes continham.
4.2.3. Métodos de análise estatística
A análise estatística dos resultados foi efectuada através do software SAS (1998). A normalidade dos dados, relativos aos níveis de comportamento higiénico manifestados pelas abelhas, foi avaliada pelo teste W de Shapiro-Wilk. A homogeneidade das variâncias foi testada pelo teste de Levene. Como os dados não seguiam uma distribuição normal, foram submetidos a uma análise de variância não paramétrica utilizando o procedimento NPAR1WAY do software SAS (1998).
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manifestados pelas colónias num mesmo método de infestação, utilizou-se o teste de Friedman. Para a testagem de diferenças significativas entre os vários grupos de alvéolos (infestados, manipulados e não manipulados) optou-se pelo teste “Wilcoxon Matched Pairs”.
As diferenças entre os três métodos de infestação, nos vários meses de estudo, foram comparadas duas a duas utilizando o teste Kruskal-Wallis. As diferenças entre os valores médios dos distintos grupos de alvéolos (infestados, manipulados e não manipulados) e dos dois comportamentos manifestados pelas colónias (comportamento I e II) entre diferentes métodos (AMC, AMN e AV) foram comparadas, duas a duas, utilizando o teste Mann-Whitney.
A relação entre os comportamentos I e II (dentro do mesmo método e entre métodos) foi analisada pelo coeficiente de correlação de Spearman’s.
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