Le séquençage sur le MiSeq

3.2.6.1 Le choix des paramètres du séquençage

Il y a un certain nombre de choix à réaliser sur les paramètres du séquençage qui vont influer sur la qualité et la profondeur de lecture des séquences obtenues :

 Le séquençage en single-end ou paired-end :

Lors d’un séquençage en paired-end, il y a une lecture de chaque séquence à partir de chacune des extrémités de l’amplicon, c’est-à-dire que pour 500 cycles, il y aura 250 bases lues à partir de l’adaptateur P5 puis 250 bases lues à partir de l’adaptateur P7. Pour un amplicon de moins de 500 pb, il y aura donc un recouvrement des deux séquences ce qui augmente la qualité de lecture des bases.

A l’inverse en « single-end », le séquençage ne se fait que par l’un des deux adaptateurs.

Afin d’augmenter la qualité de nos séquences pour ce premier essai de séquençage haut débit nous avons choisi de réaliser un séquençage en paired-

end.

Avec un kit de 500 cycles, nos amplicons qui ont une taille proche de 250 pb bénéficieront d’un recouvrement quasi-total au cours des deux lectures.  Le choix de la flowcell :

Illumina propose plusieurs flowcells de capacités différentes allant de 1

million de « reads » ou séquences lues pour 500Mb données générées à 15 millions de séquences lues pour 7,5 Gb de données générées (Tableau XVII).

En fonction de la capacité de la flowcell choisie (nombre de séquences lues), du nombre d’amplicons à séquencer et du nombre d’échantillons multiplexés, on obtiendra une profondeur de lecture théorique moyenne pour le run de séquençage.

Ainsi, si l’on prend l’exemple de la Standard Flowcell (14 millions de séquences lues) et que l’on souhaite garantir une profondeur moyenne de 1000X avec un design de cinq-cents amplicons, nous pourrons séquencer simultanément vingt-huit échantillons :

A l’inverse, si l’on souhaite séquencer vingt-quatre échantillons, la profondeur théorique moyenne sera de 1166X :

Sur la plateforme du Genotoul, seule la flowcell standard était disponible. Dans nos conditions de dix-neuf amplicons pour quinze échantillons multiplexés sur la flowcell standard, la profondeur de lecture moyenne théorique attendue est d’environ 50 000X.

3.2.6.2 Le logiciel Experiment Manager d’Illumina

Ce logiciel va nous permettre de créer et d’importer sur le MiSeq nos données concernant le run de séquençage.

Il s’agit dans un premier temps de créer la « sample plate », récapitulant les différents échantillons avec les index utilisés pour les différencier, puis dans un second temps, la « sample sheet » associée ; pour cela dans le logiciel, nous devons rentrer :

 La technique utilisée, ici technique des amplicons ;

 Le nombre d’index de lecture, un seul en P7 dans ce cas (il y aura deux index dans le kit TruSeq Custom Amplicon) ;

 Le type de séquençage : Paired-end, comme c’est le cas ici, ou Single-end ;  Le nombre de cycles défini par la version du kit, nous utilisons la version 2 en

2x250 cycles ;

 Le mode d’analyse automatique désiré pour l’analyse des données de séquençage et particulièrement l’algorithme utilisé pour la détection des variants ; nous choisirons le « somatic variant caller » pour commencer, qui est conseillé pour l’analyse des échantillons tumoraux.

14.000.000 / (500x1000) = 28

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L’étape suivante consiste à rentrer l’identification des échantillons avec les index utilisés, à partir de la « sample plate » créée précédemment.

Nous devrons aussi créer un fichier texte contenant les coordonnées, sur le génome de référence (version hg19), des différents amplicons à séquencer ; ce fichier sera utilisé lors de l’analyse pour l’alignement des séquences obtenues sur le génome. Ces fichiers créés précédemment seront chargés dans la base de données du séquenceur.

3.2.6.3 La préparation des réactifs

Le kit utilisé pour notre run est le MiSeq V2 Reagent kit box1-2 qui contient :  La cartouche de réactifs ;

 Le tampon d’hybridation HT1 (coffret n°1);

 La flowcell V2 dans une solution de conservation ;  Le tampon d’incorporation PR2 (coffret n°2).

La première étape consiste à faire décongeler la cartouche de réactifs dans de l’eau et le tampon HT1 dans de la glace. Pendant ce temps, il faut réaliser trois rinçages successifs de la fluidique du MiSeq avec du tampon tween.

A partir de la librairie à 9,75nM, nous réalisons une série de dilutions de manière à ajuster la concentration de la librairie à 20pM, comme demandé par

Illumina.

Il faut également réaliser une dilution d’un contrôle interne Illumina, le PhiX à 20pM. Ce dernier sera inclus à 10% dans notre pool final ; il s’agit d’un petit génome permettant d’avoir un contrôle qualité pour la génération des clusters, le séquençage et l’alignement, et un contrôle de calibration pour calculer la correction éventuelle à appliquer sur l’intensité lue pour le base-calling.

Illumina préconise ensuite de préparer de la soude à 0,2N dans du tampon de

lavage afin de dénaturer la librairie et le phage séparément ; le tampon HT1 sera ajouté après dénaturation et permettra d’arrêter la réaction mais également de réaliser la dilution finale du pool et du PhiX.

Le pool et le PhiX à 20pM seront finalement mélangés dans des proportions 90% - 10% et 600µL d’une ultime dilution de ce mélange à 7pM dans du tampon HT1 sera déposée dans la cartouche de réactifs décongelée dans un puits dédié.

3.2.6.4 Le chargement des réactifs et le lancement du run de séquençage

Il reste alors à charger la cartouche avec le pool d’échantillons dans le séquenceur, le tampon PR2 ainsi que la flowcell qu’il est nécessaire de rincer et sécher avant utilisation.

La flowcell est déposée à l’intérieur du séquenceur au-dessus d’un prisme permettant de dévier le laser qui excitera les fluorophores à chaque cycle de séquençage. Les fragments sont hybridés sur la flowcell puis ils subissent l’amplification en pont, la linéarisation enzymatique, le blocage de leurs extrémités 3’ et l’hybridation de la première amorce de séquençage.

Le « paired-end module » permet ensuite de retourner la molécule pour la séquencer par sa deuxième extrémité avec la deuxième amorce de séquençage.

Le séquençage dure environ 48h après lesquelles nous récupèrerons un dossier de données à analyser.