étape de clonage. Cette approche ciblée a, par exemple, permis d’analyser simultanément la diversité des bactéries, archées, protozoaires et champignons d’échantillons ruminaux (Kittelmann et al., 2013). La génération de milliers de séquences qui permet d’estimer assez précisément la diversité des populations ciblées, la mise en place facile et l’analyse bioinformatique relativement bien maitrisée (Caporaso et al., 2012 ; Schloss et al., 2009) ont rendu cette approche populaire, notamment dans l’étude des modifications des communautés 83 microbiennes sous l’influence de différents facteurs (Li et al., 2012 ; Pinloche et al., 2013 ; Zened et al., 2013 ; Thoetkiattikul et al., 2013). Toutefois, il faut savoir que ces méthodes peuvent présenter des biais liés à la technique de PCR en amont du séquençage et biais valables d’ailleurs pour les techniques précédemment évoquées. En effet, la spécificité des amorces PCR utilisées peut conduire à une surreprésentation ou sous-représentation de certains taxons (Wang et Qian, 2009 ; Klindworth et al., 2012). Le choix de la région hypervariable amplifiée peut également influencer la représentativité et la discrimination des microorganismes au sein de la communauté microbienne étudiée (Kim et al., 2011b ; Guo et al., 2013b). De plus, il faut être conscient que la représentativité de la communauté est nécessairement altérée par le nombre de copies différents des gènes de l’ADNr chez les microorganismes (Větrovský et Baldrian, 2013). V.2.2.5.2.Métagénomique et métatranscriptomique L’utilisation d’approches haut-débit dites de méta-omiques, basées sur le séquençage massif, sans a priori, d’ADN métagénomique (métagénomique) ou d’ARN métagénomique (métatranscriptomique), permettent aujourd’hui d’appréhender simultanément la composition taxonomique et les capacités métaboliques de communautés environnementales dans leur totalité en s’affranchissant des étapes de PCR. Le microbiome (communauté microbienne) et le virome (communauté virale) des écosystèmes digestifs des ruminants (vache, yak, renne), d'animaux monogastriques comme le porc et de l'homme ont ainsi été explorés par métagénomique (Brulc et al., 2009 ; Pope et al., 2012 ; Dai et al., 2012 ; Berg Miller et al., 2012 ; Lamendella et al., 2011 ; Looft et al., 2012 ; Shan et al., 2011 ; Qin et al., 2010) et ont permis d’étudier la diversité taxonomique par analyse de marqueurs phylogénétiques et d’effectuer un inventaire des gènes fonctionnels de ces microbiotes. Toutefois, la métatranscriptomique est considérée comme plus informative en révélant les communautés microbiennes actives qui ne sont pas forcément les communautés dominantes (Torsvik et Øvreås, 2002), les ARNm et les ARNr étant vus comme des indicateurs des microorganismes métaboliquement actifs. Chez le ruminant, deux études métatranscriptomiques ont été réalisées, l’une sur la communauté eucaryote du rumen du bœuf musqué (Qi et al., 2011) et l’autre sur la communauté totale du rumen de vache (Poulsen et al., 2013). Cette dernière a été effectuée par séquençage des ARN totaux et a conduit à la détection de seulement 3% d’ARNm (380000 à 485000 séquences), ce qui limite forcément les capacités de détection des ARN des communautés les moins abondantes et le traitement statistique des données au vu de 84 la diversité du microbiote ruminal. Dans ce type d’étude, l’enrichissement en ARNm qui permet de soustraire les ARNr est une étape critique, car les ARNm qui reflètent l’activité métabolique des microorganismes ne représentent que quelques pourcents des ARN totaux. Cependant, du fait de la diversité énorme des microorganismes des écosystèmes digestifs, en particulier ceux du rumen, l’efficacité des méthodes commerciales reste limitée (Poroyko et al., 2010 ; Edwards et al., 2011). Qi et al. (2011) ont ciblé les ARNm eucaryotes polyadénylés qui sont de ce fait facilement isolables par capture à l’aide de billes polydT. Leur approche a été utilisée dans l’objectif d’enrichir les bases de données en séquences d’eucaryotes ruminaux, peu retrouvées dans les métagénomes, du fait de leur faible abondance dans le microbiote ruminal. Ceci souligne que, malgré l’immense quantité de données générées, l’accession à l’ensemble des génomes contenus dans un échantillon reste encore difficile. Avec la complexité des écosystèmes digestifs, les efforts de séquençage doivent ainsi être poussés afin de couvrir au maximum la diversité microbienne. En 2008, Quince et al. ont ainsi estimé qu’il serait nécessaire de multiplier par 10000 les efforts de séquençage pour couvrir 90% de la diversité microbienne d’écosystèmes complexes. Par ailleurs, le manque de génomes de référence reste un facteur limitant dans l’analyse des données obtenues. Dans l’étude métatranscriptomique des eucaryotes ruminaux, 48% des séquences n’ont pas trouvé de similarité avec des séquences de bases de données. L’établissement d’un catalogue de génomes ruminaux de référence, analogue à celui utilisé pour l’analyse des métagénomes/métatranscriptomes de l’homme (Human Microbiome Jumpstart Reference Strains Consortium et al., 2010), a donc été lancé avec le projet Hungate 1000 (www.hungate1000.org.nz) qui vise le séquençage de 1000 souches microbiennes ruminales. La disponibilité de ces génomes de référence permettra sans nul doute de faciliter l’analyse des séquences obtenues et de mieux investir les différentes fonctions du microbiote ruminal. Malgré tout, il est possible de reconstruire des génomes sans génome de référence, mais l’efficacité des logiciels disponibles reste encore à démontrer pour des communautés microbiennes aussi complexes que les microbiotes digestifs (Morgavi et al., 2012). De plus, la taille relativement courte des séquences obtenues peut compliquer l’assemblage et la reconstruction de génomes complets. La perspective de l’utilisation du séquençage « single-cell » (Lasken, 2012), offrant la possibilité de séquencer le génome d’une seule single-cellule, est prometteuse et devrait permettre d’enrichir le nombre de génome de référence en particulier provenant de microorganismes non cultivés. Il est aussi essentiel de pouvoir progresser dans l’annotation des génomes afin d’identifier au mieux les capacités métaboliques des communautés microbiennes étudiées (Gilbert et al., 2008). Pour ceci, il est parfois nécessaire 85 Dans le document Evolution structurale et fonctionnelle des communautés microbiennes digestives sous l'influence de facteurs biotiques et abiotiques. Développement d'une biopuce ADN ciblant les gènes impliqués dans la dégradation des glucides complexes alimentaires (Page 105-108)
