Séparation —

2.1 Supports de séparation

Comme son nom l’indique, les séparations sont en général réalisées dans des canaux de dimensions capillaires. Les supports classiques sont généralement des tubes de silice fondue mais plus récemment les puces se sont développées et constituent une véritable avancée, notamment en termes de rapidité d’analyse (figure 2).

2.1.1 Capillaires

Les capillaires sont le plus souvent constitués de silice fondue, revêtus d’une couche de polyimide afin d’en assurer la flexibilité. Leurs dimensions sont en général comprises entre 10 et 100 cm de longueur et 20 à 75 µm de diamètre interne.

Ce type de capillaire est utilisé dans de nombreuses d’applica- tions. Néanmoins, certaines études mentionnent l’intérêt de capillaires qui vont différer de par leur géométrie, la nature du revêtement externe ou encore celle de leur surface interne.

Ainsi, des capillaires à section carrée ou rectangulaire ont été utilisés en raison de leur meilleure capacité à dissiper la chaleur et des plus faibles distorsions optiques engendrées par les surfaces planes mais leur emploi reste anecdotique.

Des revêtements externes autres que le polyimide tels que les fluoropolymères (Téflon®AF) permettent de disposer de capillaires totalement transparents aux UV. Ce type de capillaire est devenu très

populaire avec le développement des techniques électrochromato- graphiques et permet la synthèse de la phase stationnaire directe- ment in situ par des réactions de polymérisation photo-initiées.

La surface interne des capillaires de silice est constituée de sila-

nols dont l’ionisation permet de générer un flux électroosmotique dirigé vers l’anode. Ce dernier joue un rôle primordial dans le processus de séparation et doit être optimisé afin d’améliorer la sélectivité, de réduire les temps d’analyse mais aussi d’éliminer l’adsorption de certains composés à la surface de ces silanols. Une des options consiste à greffer chimiquement ces silanols. Différents protocoles ont été élaborés en fonction de la nature du greffon.

Certains d’entre eux sont disponibles commercialement. Pour ne citer que les plus courants :

– capillaires neutres (greffés par du polyacrylamide ou du polyvinylalcool) ;

– capillaires chargés positivement (greffés par des polymères présentant des groupements ammonium quaternaire) ;

– capillaires présentant une charge de surface réduite par des greffons alkyle, diol.

D’autres capillaires en polytétrafluoroéthylène (Téflon) ou perfluoroalkoxy (Teflon-PFA) peuvent être utilisés en raison de leur surface non polaire qui devrait présenter des capacités de sorption des ions métalliques et des molécules multichargées plus faibles. 2.1.2 Puces

La géométrie des systèmes sur puce diffère quelque peu de celle des capillaires. Dans le cas des systèmes les plus simples, la configuration adoptée est une géométrie en forme de croix, repré- sentée sur la figure 2b. Cette géométrie présente deux avantages : – d’une part, pallier l’absence de passeur d’échantillons en entrée du capillaire de séparation ;

– d’autre part, permettre l’injection de volumes d’échantillons définis comme nous le verrons dans le paragraphe 3.

Ceux-ci ne sont pas détaillés dans cet article mais le lecteur pourra se référer à deux articles, l’un traitant plus spécifique- ment du greffage par le polyacrylamide linéaire [5], l’autre présentant un panorama plus général du greffage par les polymères [6].

Figure 2 – Supports de séparation utilisés en électrophorèse capillaire (doc. S. Huynh, A. Hagège)

a capillaire de silice b puce en verre

Annexes

ÉLECTROPHORÈSE CAPILLAIRE ________________________________________________________________________________________________________

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Cependant, l’évolution des techniques de gravure permet d’envi- sager des géométries plus complexes, notamment des puces mul- ticanaux permettant la séparation en parallèle d’un nombre élevé d’échantillons.

Les substrats utilisés pour la fabrication sont principalement en verre ou en polymère.

2.1.2.1 Technologie de fabrication pour les puces en verre Les supports en verre sont généralement réalisés en utilisant les techniques photolithographiques. La réalisation de tels supports comprend trois grandes étapes principales.

La première étape consiste à déposer une couche de résine

photosensible sur le substrat de verre dont l’épaisseur est contrôlée généralement par ajustement de la viscosité de la résine et de la vitesse de rotation lors du dépôt.

La seconde étape, appelée développement, consiste alors à exposer cette résine à la lumière au travers d’un masque dont le tracé conditionne les fonctionnalités de la future puce. Si la résine photosensible est dite positive alors les zones exposées à la lumière deviennent solubles dans l’agent développeur ; dans le cas d’une résine négative, ces mêmes zones deviendront insolubles (figure 3).

La dernière étape est l’étape de gravure du support. Elle consiste à attaquer les zones non protégées par la résine. Deux techniques de gravure sont généralement mises en œuvre :

– la gravure par voie humide, réalisée grâce à des solutions aqueuses généralement acides (HF), mais aussi basiques (KOH) dont le choix est fonction du support à graver mais aussi de la géométrie des cavités que l’on souhaite créer. Cette technique est relativement simple à mettre en œuvre mais souvent isotrope ;

– la gravure par voie sèche, qui utilise un plasma ionique et permet soit une attaque physique, soit une attaque chimique du support ou encore une combinaison des deux.

2.1.2.2 Technologie de fabrication pour les puces en polymère

De nombreux polymères peuvent être théoriquement utilisés mais le polydiméthylsiloxane PDMS, de formule semi-développée CH₃[Si(CH₃)₂O]nSi(CH3)3, tend à supplanter les autres, notamment grâce à sa transparence aux UV qui permet l’utilisation des détecteurs optiques.

Un de ses avantages sur le verre ou le silicium est la possibilité d’un coût de production beaucoup moins onéreux des puces qui pourrait faire de celles-ci des appareils jetables.

Les techniques de fabrication les plus utilisées sont :

– l’ablation laser, qui permet de casser les liaisons covalentes des chaînes de polymère et d’éjecter les fragments, créant ainsi des cavités. Comme dans la technologie dite « dure », utilisée pour le silicium et le verre, l’utilisation d’un masque permet d’obtenir le tracé voulu. De nombreux polymères sont sensibles à l’ablation laser, malheureusement, le procédé même compromet la possibilité d’une production massive de puces ;

– la technologie dite « plastique », qui tend progressivement à remplacer les autres au vu de ses nombreux avantages.

Cette dernière comporte deux étapes. La première consiste à réaliser un négatif de la puce que l’on souhaite obtenir. Ce négatif peut être réalisé en verre, silicium ou résine en utilisant les procé- dés vus précédemment (§ 2.1.2.1 et 2.1.2.2). La seconde étape consiste à répliquer le gabarit ainsi obtenu par moulage, matriçage ou injection. Cette étape dure entre quelques secondes et quelques heures selon le procédé choisi.

Cependant, le PDMS est relativement hydrophobe et les solvants polaires comme l’eau ont du mal à pénétrer dans les canaux. L’oxy- dation du PDMS à l’aide d’un plasma, conduisant à la formation de groupements silanols en surface, permet de lui conférer une bonne mouillabilité. Cette modification n’est cependant pas permanente et le PDMS retrouve son hydrophobie au contact de l’air. Il peut cepen- dant être fonctionnalisé, notamment via des trichlorosilanes. 2.2 Générateurs de haute tension

Le générateur permet d‘imposer une différence de potentiel entre les deux électrodes de platine, situées à chaque extrémité du capil- laire. Cette différence de potentiel est essentielle, non seulement lors de la séparation, mais aussi lors de certains types d’injection (§ 3.2). Les gammes de tension et de puissance requises pour les générateurs de haute tension diffèrent selon l’échelle à laquelle la séparation est réalisée. Le choix du générateur dépend donc du for- mat choisi (capillaire ou puce). En format capillaire, la gamme de tension varie entre 0 et ± 30 kV pour des courants générés de l’ordre de 300 µA, alors que celle-ci varie entre 0 et ± 3 kV pour des courants de 100 µA environ dans le cas des puces.

Ainsi, même si les tensions utilisées sont très élevées, les courants générés sont trop faibles pour mettre en danger la vie de l’opérateur. Cependant, les courants de fuite sont la principale cause de bruit de fond et peuvent sérieusement endommager les circuits électroniques internes.

Le choix le plus judicieux pour des raisons de fiabilité mais aussi de sécurité est l’utilisation d’un générateur à double polarité. Ce type de générateur équipe la majorité des instruments commercialisés modernes.

2.3 Thermorégulation

Les courants générés lors de l’application d’un voltage dans un capillaire conduisent à un échauffement (encore appelé effet Joule) du capillaire et de l’électrolyte. Les transferts de chaleur avec les parois du capillaire vont conduire à une température plus élevée au centre du capillaire. Ce gradient de température est préjudiciable à la séparation et il est donc nécessaire de dissiper cette chaleur. Le mode classique est l’utilisation de la convection forcée faisant appel soit à des liquides (en général des hydrocarbures halogénés), soit à de l’air. Les liquides possèdent en général une meilleure capacité d’absorption de la chaleur et sont d’une plus grande souplesse d’uti- lisation, notamment lors de couplages externes (§ 4.3) mais l’air présente des avantages en termes de sécurité.

P. Tabeling consacre un chapitre de son « Introduction à la microfluidique » [7] aux divers procédés de microfabrication. Un aperçu en est donné dans les paragraphes qui suivent mais de nombreuses sociétés proposent à la vente des puces de géométrie prédéfinie ou dont le design peut être modulé à façon.

Figure 3 – Fabrication des puces : étape de développement Utilisation d’une

résine positive Utilisation d’une

résine négative Source lumineuse

Pour plus de détails, le lecteur pourra consulter la référence [8] qui dresse un inventaire détaillé des générateurs de haute tension à la fois commerciaux et développés dans les laboratoires de recherche.

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________________________________________________________________________________________________________ ÉLECTROPHORÈSE CAPILLAIRE

Dans les puces, il est communément admis que les consé- quences de l’effet Joule sont moins prononcées [9].