Sélection des configurations électroniques à traiter

Avanços tecnológicos obtidos na última década geraram novas metodologias para genotipagem de marcadores SNP, o que revolucionou os limites da utilização de dados moleculares nos estudos com genes candidatos de sequências reguladoras das proteínas do leite (Caetano, 2009). Conforme Kaminski et al (2005), em se tratando de rebanho bovino leiteiro em associação às suas características de interesse econômico, para uma maior exploração da variação de proteínas no teor do leite, um número maior de marcadores SNPs pode favorecer os resultados. Para estes autores, justifica-se o interesse em SNPs em decorrência de sua utilização na identificação de genes associados a doenças multifatoriais e QTL. Supõe-se que, em alelos próximos, os SNPs são herdados em conjunto com os QTLs através das gerações.

Os resultados apresentados neste capítulo comprovam a eficácia do ensaio

GoldenGate para avaliação de genotipagem de SNPs em painéis de baixa densidade,

evidenciando o amplo potencial na detecção e seleção de um grande número de marcadores SNPs. No mesmo sentido, González-Neira (2013) aponta para a viabilidade da metodologia

GoldenGate em procedimentos de genotipagem em painéis personalizados de SNPs. Segundo

a autora, esta ferramenta promove garantias na verificação de frequências dos alelos menores, bem como permite obtenção de maior probabilidade de sucesso na validação do experimento. Para esta autora, frente aos critérios de filtragem que excluem do experimento amostras e marcadores não confiáveis, é possível estabelecer painel de marcadores de SNPs de baixa densidade para verificação de critérios como reprodutibilidade e heranças genéticas. De acordo com Ziegler (2009), SNPs genotipados de forma inconsistente ou que não contribuirão

para a acurácia das avaliações genéticas devem ser excluídos no sentido de reduzir esforços computacionais, diminuir a quantidade de resultados falsos e melhorar a precisão das análises realizadas com os polimorfismos restantes.

Conforme Lin et al. (2009), é primordial a seleção de ferramentas que melhor se adaptem ao objetivo do trabalho, que ofereçam consistência no desempenho, flexibilidade em conteúdo, rapidez na geração de dados, e acessibilidade para estudos em larga escala. Para Kaminski et al. (2005), a genotipagem de SNPs em intervalos regulares, possibilita a detecção de regiões genômicas que apresentam variação nas frequências alélicas, auxiliando os processos de avaliação genética e melhoramento animal.

Também com intuito de desenvolver e validar um método rápido para a genotipagem das principais mutações das proteínas do leite bovino, Chessa et al. (2007) realizaram experimento com microchips, para a identificação simultânea de 22 SNPs localizados em 8 diferentes regiões de genes relacionados com a proteína do leite. A plataforma utilizada permitiu inserção e deleção polimorfismos para serem genotipados. Conforme os resultados deste estudo, através de microchips, foi constatada facilidade de genotipagem de diferentes regiões genômicas, que poderiam ser investigadas para estudos filogenéticos e de associação; avaliação das distâncias genéticas entre raças de bovinos; história da espécie bovina e identificação de parentesco.

Onteru et al. (2011) analisando características reprodutivas em porcas, utilizaram um limiar de MAF > 0,001 e eficiência de genotipagem >80% para verificar o EHW e excluir de SNP com erros de genotipagem. O Gentrain Score, utilizado nesta análise, baseou-se na análise de agrupamento dos genótipos, que foram realizadas por meio do Gen

Call score da Illumina. Após este controle de qualidade foram removidos 6.814 SNPs (11%)

do banco de dados genotípico. Estes autores foram menos rigorosos com os limiares estabelecidos nos critérios de qualidade dos marcadores/amostras de animais, em comparação aos adotados no presente capítulo.

Fan et al. (2011), avaliando características de composição corporal em suínos, utilizaram um limiar de MAF >0,05, eficiência de genotipagem > 80% e p-valor < 1x10-6 no teste de χ2 para verificar o EHW para exclusão de SNP. Neste estudo de Fan et al. (2011), excluíram-se inicialmente 5 amostras por apresentarem eficiência de genotipagem menor que 0,80, e no controle de qualidade dos SNPs foram removidos 2.286 com eficiência de genotipagem inferior a 90% e por falharem na genotipagem (no call). Desta forma, estes

autores alcançaram aproximadamente 50K SNPs, os quais foram utilizados para análises de associação.

Ankunov et al. (2009) aplicaram a tecnologia VeraCode para a genotipagem de SNPs em experimentos com trigo. A metodologia foi eficiente em determinar amostras polipóides do trigo, com uma média de 89% tetraplóides e 84% de genótipos hexaplóides. Neste experimento, após filtragem de SNPs de baixa qualidade, foi constatada precisão de genotipagem com média de 99% para hexaplóides e 100% para tetraplóides. De acordo com os estudos de Deulvot et al. (2010), em experimento realizado também com cultivo de vegetal (ervilha), o ensaio GoldenGate mostrou-se de mesma eficácia na validação do painel de SNPs. Este painel estava composto inicialmente de 384 SNPs, dos quais 356 SNPs (92,7%) permaneceram após a aplicação dos critérios de filtragem, mantendo nível acima de 94% para o parâmetro de qualidade GenTrain. Assim como na pesquisa foco deste estudo, a tecnologia

GoldenGate foi utilizada nos experimentos de Ankunov et al. (2009) e Deulvot et al (2010),

os quais destacaram como ferramenta adequada para verificação de variações genética de locos relacionados com características complexas, apresentando resultados favoráveis a este tipo de cultura.

Os valores médios observados e esperados de heterozigosidade para os marcadores foram considerados dentro das expectativas, visto que os SNPs são marcadores bialélicos e que alguns iria apresentar variabilidade reduzida (SNPs relacionados a doenças genéticas). Estes números foram comparados e mostraram-se semelhantes aos obtidos em trabalhos que também tem utilizados marcadores para análises de paternidade em bovinos (Fisher et al., 2009; Hara et al., 2010). Os três painéis se mostraram eficientes na identificação de indivíduos não relacionados e na confirmação de paternidade quando se possui a informação de ambos os pais, uma vez que os valores de não exclusão foram abaixo de 0,0% (exclusão de 99%).

Verificou-se neste estudo que a metodologia GoldenGate, tanto otimiza a pesquisa quanto garante maior eficácia de dados obtidos, sendo, consequentemente, considerada ferramenta de sucesso para a validação do painel proposto. A proporção geral de SNPs polimórficos observados neste estudo (para 576 animais) considerando todos os 384 SNPs foi estimada em 71,6%. Após aplicação dos critérios de filtragem, foi possível observar uma redução da proporção de SNPs polimórficos (53,4%), porém estes marcadores foram considerados mais robustos. O painel validado de 249 SNPs pode ser utilizado com diferentes propósitos na raça Girolando. Os resultados obtidos através da análise de componentes

principais revelaram a eficiência que este painel, permitindo que seja utilizado em estudos de estruturação genética, estimação do grau de diversidade dentro e divergência genética entre populações, possível identificação de QTL e de regiões do genoma associadas a características de produção leiteira aptas à seleção. Mediante comparação do experimento aqui apresentado e demais estudos fundamentados nesta ferramenta, constata-se a eficácia do painel personalizado por meio da qualidade na geração dos genótipos dos SNPs, visando melhorias da qualidade e produtividade leiteira.