Sécrétion de la GFP-Tau4R

Pour étudier la sécrétion, les cellules ont été transfectées 24h après avoir été mises en culture. Le milieu de culture des cellules contenant la protéine Tau sécrétée a été récolté entre 24 et 51 heures après la transfection. Les cellules ont été lysées dans un volume de 6 ml de milieu frais contenant 0,1% de triton et des inhibiteurs de protéases

puisque le milieu de culture récolté était de 6 ml. Cette méthode a permis de diluer la protéine Tau et les autres composants intra et extracellulaires de la même façon pour ainsi permettre de comparer leur quantité dans le lysat et le milieu. Les milieux et lysats ainsi récoltés ont ensuite été analysés par immunobuvardage avec l'anticorps polyclonal de AbCam dirigé contre Tau (Figure 8/B , p.52). L'expression de Tau, tel qu'observé dans le lysat cellulaire, était équivalente pour les cellules récoltées entre 41 et 51 heures. Par contre, l’expression de Tau à 24 heures était moins grande que ces dernières, tel qu’attendu. À tous ces temps, on a pu observer dans les lysats cellulaires la présence de la bande de Tau pleine longueur, tout juste au-dessus du 75 kDa. De plus, on a pu observer la présence d'une bande de Tau à 75 kDa, sous la protéine Tau pleine longueur, ainsi que des bandes de plus faibles poids moléculaire entre 25 et 50 kDa. On a pu voir que dès 24 heures après la transfection la protéine Tau apparaissait dans le milieu de culture. La quantité de Tau extracellulaire augmentait de façon importante à 41 heures et encore un peu à 51 heures. Par contre, on a pu remarquer que la bande principale de Tau dans le milieu se trouvait à 75 kDa, donc tout juste sous la protéine Tau pleine longueur. Cette dernière était d'ailleurs présente uniquement dans le lysat cellulaire. De plus, on a pu remarquer que les bandes de Tau clivée se trouvant sous les 50 kDa dans le lysat cellulaire étaient également présentes dans le milieu de culture. Ces résultats ont donc suggéré que la protéine Tau était sécrétée sous forme clivée uniquement, la pleine longueur n'étant pas sécrétée dans ce modèle cellulaire.

Par contre, il a fallu démontrer que la présence de Tau dans le milieu de culture n'était pas due à la fuite de protéines à travers la membrane plasmique de cellules endommagées ou mortes. Pour vérifier l'intégrité de la membrane plasmique, nous avons donc regardé si une protéine cytosolique non-sécrétée pouvait se retrouver dans le milieu de culture de nos échantillons. Si c'était le cas, cela aurait signifié que la membrane laissait échapper des protéines cytosoliques et par conséquent que la présence de Tau dans le milieu n'était pas due à la sécrétion. Les échantillons ont donc été repris et marqués à la tubuline grâce à l'anticorps DM1A (Figure 8/C, p.52). On a donc pu voir que la tubuline était présente dans tous les lysats cellulaires mais complètement absente des milieux de culture. Ceci démontrait une bonne intégrité de la membrane plasmique et démontrait donc que la protéine Tau a emprunté un mécanisme cellulaire de sécrétion afin d'être libérée dans le milieu de culture.

Figure 8. Sécrétion de la protéine GFP-Tau4R dans des cellules HeLa.

A) Les cellules HeLa ont été transfectées avec de la GFP-Tau4R ou la GFP seule et

lysées 48 heures plus tard. Les cellules transfectées à la GFP nous ont servi de témoin négatif afin de détecter d’éventuelles bandes non-spécifiques avec les anticorps dirigés contre Tau puisque les cellules HeLa sont dépourvues de Tau endogène. Le lysat a été analysé par immunobuvardage afin d'examiner le niveau de transfection et de vérifier la spécificité de nos anticorps. On a donc pu observer la bande de GFP-Tau4R pleine longueur tout juste au-dessus de 75 kDa (flèche) ainsi que plusieurs bandes de plus faibles poids moléculaire indiquant que la GFP-Tau4R était clivée dans les cellules HeLa. L'anticorps HT7, Tau12 ainsi qu'un anticorps dirigé contre Tau obtenu de AbCam ont été testés. Ces deux premiers étaient très spécifiques alors que l'anticorps de AbCam présentait un marquage non-spécifique un peu en haut de 50 kDa ainsi que deux bandes dans les environs de 150 et 250 kDa. B) Le milieu de culture des cellules HeLa transfectées avec GFP-Tau4R a été collecté à 24, 41 et 51 heures après la transfection puis les cellules ont été lysées. L'anticorps de AbCam nous a révélé que la protéine Tau était présente dans le milieu des cellules exprimant la GFP-Tau4R mais pas dans celui des cellules exprimant GFP (flèche du bas). Fait intéressant, la protéine Tau pleine longueur (flèche du haut) n'était présente que dans le lysat et non dans le milieu. C) Pour vérifier que la protéine Tau observée dans le milieu ne provenait pas d'une fuite à travers la membrane plasmique des cellules due à la mort cellulaire, les échantillons ont été marqués à la tubuline. Aucune tubuline n'a été détectée dans les milieux de culture alors qu'elle était présente dans les lysats cellulaires (flèche, 50 kDa). Il est important de préciser que le lysat a été fait dans 6 ml afin d'avoir le même volume que dans notre milieu de culture et d'ainsi pouvoir comparer le signal obtenu avec l’anticorps anti-tubuline. D) Pour éliminer la possibilité que ce soit le tag GFP qui soit la cause de la sécrétion de Tau, les cellules HeLa ont été transfectées avec de la Flag-Tau4R. Cette Tau était aussi présente dans le milieu de culture avec un clivage semblable à ce qui a été observé pour la GFP-Tau4R.

Après avoir ainsi démontré la sécrétion de Tau, il était important de vérifier que cette sécrétion n'était pas due à la présence du tag GFP. En effet, une étude avait démontré que la GFP pouvait être sécrétée par plusieurs types cellulaires (Tanudji, Hevi et al. 2002). Il était alors impératif de prouver que la sécrétion de la protéine Tau n'était pas due à un effet d'entraînement par la GFP. Pour ce faire, nous avons transfecté les cellules HeLa avec la Tau4R contenant le tag Flag en N-terminal, au lieu du tag GFP (Figure 8/D, p.52). Nous avons ainsi pu observer que la Flag-Tau4R, migrant à 50 kDa dû au très faible poids moléculaire de la Flag ne contenant que 8 a.a. (Hopp, Prickett et al. 1988), était tout autant sécrétée que la GFP-Tau4R. De plus, comme observé pour la protéine Tau fusionnée au tag GFP, la Flag-Tau4R sécrétée était également clivée. Ces résultats démontraient donc que la sécrétion de la GFP-Tau4R n'était pas imputable au tag GFP.