Garin, and R. Sadoul
Article 1 Sécrétion des exosomes par les neurones corticaux en culture
Nous avons pu montrer au cours de ces premiers travaux que les neurones corticaux en culture sécrètent des exosomes auxquels sont associées des protéines exosomales classiques, comme Alix, Tsg101, et la flotilline, et également des protéines neuronales, comme la molécule d’adhésion neuronale L1 et les sous unités GluR2/3 des récepteurs au glutamate. De façon très intéressante, la protéine du prion cellulaire (PrPc) est également présente dans les exosomes sécrétés dans ces cultures. Enfin, une dépolarisation de la culture dans un milieu hyperpotassique permet d’augmenter de façon drastique la sécrétion d’exosomes, ce qui montre qu’il existe une régulation de la production des exosomes par l’activité neuronale.
Résultats
1. Purification des exosomes de cultures primaires de neurones corticaux
Après avoir établi un protocole de purification d’exosomes à partir d’une lignée cellulaire disponible au laboratoire, et mis au point la culture de neurones de cortex provenant d’embryons de rat (E18), nous avons appliqué le protocole de purification sur le milieu des neurones à 8 jours de culture in vitro. La purification sur gradient de sucrose a révélé la présence de la protéine Alix dans les fractions centrales (1,11 à 1,19 g/ml), ce qui témoigne de l’existence d’exosomes dans le surnageant de culture des neurones. En collaboration avec Graça Raposo de l’institut Curie à Paris, nous avons pu observer en microscopie électronique les vésicules contenues dans les fractions centrales du gradient (5-6). La population de vésicules est homogène, d’environ 100nm, ce qui confirme qu’il s’agit bien d’exosomes.
2. Protéines sécrétées par les exosomes de culture primaire de neurones corticaux
Nous avons ensuite réalisé une étude en spectrométrie de masse, grâce à une collaboration avec Jérome Garin du CEA de Grenoble, pour détailler les protéines présentes dans les exosomes sécrétés par les cultures primaires de neurones corticaux. La spectrométrie de masse a révélé la présence de protéines déjà décrites dans les exosomes des autres types cellulaires : tubuline, actine, protéine Gα, Alix, clathrine, Hsc70, pyruvate kinase, 14-3-3, GAPDH.
Nous avons poursuivi l’analyse protéomique des exosomes par Western-blot, et nous avons pu détecter les protéines Tsg101 du complexe ESCRT I et la flotilline. Nous avons également révélé la présence de la molécule d’adhésion cellulaire L1, qui est une protéine exprimée spécifiquement dans les neurones au niveau du système nerveux central, et des sous-unités GluR2 ou 3 (l’anticorps reconnaît la partie commune aux deux sous-unités) des récepteurs au glutamate. Aucune présence de protéines du cytosquelette (MAP2, Tau) ni de l’enzyme membranaire NA+/K+ ATPase n’a été détectée dans les fractions Alix-positives, ce qui montre qu’elles ne sont pas contaminées par des débris cellulaires, ni des morceaux de membrane plasmique. Enfin, la protéine PrPc se retrouve également dans ces fractions, confirmant comme Février et al l’avaient suggéré en 2004, que la protéine peut emprunter cette voie pour être sécrétée dans le milieu extracellulaire.
L’approche protéomique a également montré la présence de Glast1 dans les exosomes sécrétés cultures de neurones corticaux. Glast1 est un transporteur membranaire exprimé spécifiquement par les cellules gliales. Cette observation démontre que les cellules gliales qui sont toujours présentes dans les cultures primaires de neurones corticaux malgré l’ajout d’AraC, sécrètent elles aussi des exosomes. Ces résultats ont été confirmés par Taylor et al en 2007, qui montrent que les astrocytes en culture sécrètent des exosomes.
Pour confirmer l’existence d’exosomes neuronaux, nous avons utilisé des neurones corticaux prélevés chez la souris transgénique Thy-1-YFP, qui surexprime la YFP (Yellow fluorescent protein) sous la dépendance du promoteur du gène Thy-1, qui restreint l’expression de la YFP aux neurones. La YFP soluble dans le cytosol rempli les vésicules intraluminales au cours de leur formation dans les endosomes. Les exosomes récoltés dans ces cultures contiennent la YFP, ce qui confirme que les neurones sécrètent des exosomes.
3. Hétérogénéité des exosomes des cultures corticales
Alix et Tsg101 colocalisent parfaitement dans des fractions étendues entre 1.12 et 1.19 g/ml de sucrose, tandis que PrPc, GluR2/3 et L1 sont restreints aux fractions allant de 1.15 à 1.19 g/ml de sucrose. Alix et Tsg101 étant exprimées de façon ubiquitaire, ces marqueurs exosomaux sont certainement présents dans les exosomes neuronaux, mais aussi les exosomes des cellules gliales. En revanche, L1 est exclusivement neuronal, et GluR2/3 est majoritairement exprimé dans les neurones, même si certaines études montrent une expression des GluR dans les astrocytes (Fan et al, 999). Ces deux protéines marqueraient donc préférentiellement les exosomes neuronaux, qui seraient une sous-population de l’ensemble
des exosomes trouvés dans les cultures primaires de cortex. Les fractions contenant PrPc correspondent à cette sous-population, ce qui suggère que cette protéine est bien présente dans les exosomes d’origine neuronale.
4. Morphologie des exosomes et immunogold
Nous avons pu montrer que les exosomes sécrétés par les cultures de neurones corticaux ont également la même forme « en hématie » que les exosomes des autres types cellulaires, par l’observation en microscopie électronique des vésicules contenues dans les fractions centrales (5-6-7) d’un gradient. Leur taille est d’environ 100nm. Des immunogold pratiqués sur ces exosomes confirment la présence d’Alix et de GluR2 dans ces vésicules.
5. Régulation de la production d’exosomes par l’activité neuronale
L’activité spontanée des cultures neuronales peut être augmentée en élevant la concentration extracellulaire en potassium. Cette élévation conduit à une dépolarisation de la membrane neuronale, et facilite ainsi le déclenchement des potentiels d’action. Nous avons incubé les neurones corticaux dans un milieu contrôle (contenant 5mM de potassium, potentiel de membrane : -65mV) ou dans un milieu dépolarisant (25mM de potassium, potentiel de membrane : -30mV) pendant 3h, puis purifié les exosomes sécrétés sur gradient de sucrose. La détection du marqueur exosomal tsg101 (non montré) et de GluR2/3 nous a permis de montrer que l’augmentation de l’activité neuronale accroît de façon très importante la production d’exosomes par les cultures. Le temps long d’incubation ne permet pas de savoir si cette augmentation d’exosomes dans le milieu extracellulaire provient de l’augmentation de la fusion des endosomes multivésiculaires avec la membrane plasmique, ou indirectement d’une augmentation de l’endocytose due à l’activité neuronale accrue.