1.3 Invariants Modulaires d’un polygone
2.1.2 Les revˆetements de genre 2
Em função do suporte utilizado no cultivo (gelatina porcina ou gel de polímero de cana-de-açúcar), ao final de 15 dias do processo de diferenciação observamos intensa coloração de nódulos de mineralização pelo método de von Kossa, que se apresentam coalescentes e formando grumos (Figura 8C e 8F), especialmente sobre aquelas células cultivadas sobre o biopolímero (Figura 8F).
A B C
D E F
Figura 8. Coloração de matriz mineralizada com von Kossa. A, B e C: Diferenciação osteogênica de
CTMs cultivadas em suporte com gelatina porcina. D, E e F: CTMs cultivadas em suporte com gel de biopolímero de cana-de-açúcar. Notar em C e F (ao final de 15 dias de cultura), em cor escura (preto), a presença de nódulos de mineralização; microscópio de contraste de fase invertido, aumento de 400x.
CARVALHO, C. L. DISCUSSÃO 47
7 DISCUSSÃO
O termo biopolímero é usado para descrever uma variedade de materiais que geralmente podem ser divididos em duas categorias: produzidos por sistemas biológicos e polímeros sintetizados quimicamente, mas derivados de materiais de natureza biológica. Nos últimos anos, os biopolímeros produzidos por microrganismos têm despertado especial atenção. Essa é uma das formas de biomateriais em que a engenharia genética pode ser amplamente aplicada. (GROSSKINSKY et al., 2006; VALEMA; KAPLAN, 2006).
O biopolímero de cana-de-açúcar tem-se apresentado como um biomaterial de grande interesse para inúmeros grupos de pesquisa que visam o emprego do mesmo em variadas áreas de investigação. Esse biomaterial tem uma aplicação comprovada para diferentes finalidades na área biomédica, sendo produzido na região com baixo custo de produção e apresentando como fonte uma matéria-prima abundante. Todavia, resultados de pesquisas dirigidas a utilização do biopolímero de cana-de-acúcar para o cultivo de CTs são poucos ou ainda inexistentes e, por se tratar de uma ciência nova, os estudos envolvendo outros tipos de biopolímeros associados ao cultivo dessas células estão em desenvolvimento.
A biocompatibilidade é a primeira característica a ser avaliada para aplicação clínica de um biomaterial. Em um estudo com o biopolímero de cana-de-açúcar, macrófagos alveolares de ratos foram cultivados sobre o biomaterial para avaliação da citotoxicidade. Apesar de a cultura ter sido realizada por um período curto de tempo, as células cresceram in vitro, e o biopolímero apresentou baixa citotoxicidade (CASTRO et al., 2004).
A utilização de um implante para a regeneração e reparação tecidual é determinada pela resposta das células à superfície do material (WILSON et al., 2005). Ou seja, uma resposta celular adequada, em que haja adesão e espraiamento após implante em substratos biológicos, é essencial para aplicabilidade dos biomateriais na engenharia tecidual.
Neste estudo, a hipótese de que o biopolímero de cana-de-açúcar poderia ser utilizado como novo suporte para cultivo de CTMs foi confirmada. Os suportes biológicos para cultivo de células têm a finalidade de manter o crescimento celular para o desenvolvimento de um novo tecido (WILLIAMS, 1999). As CTMs apresentaram capacidade de adesão, espraiamento e proliferação sobre o gel e
CARVALHO, C. L. DISCUSSÃO 48
membranas do biopolímero de cana-de-açúcar. Isso demonstra que ocorreu uma favorável interação das CTMs com o biomaterial.
A adesão das CTMs ao gel de biopolímero de cana-de-açúcar quando comparada a gelatina porcina aconteceu de forma mais lenta. O polímero poli(L- ácido lático) (PLLA) e o copolímero de 3-hidroxibutirato e 3-hidroxivalerato (PHBV), polímeros biorreabsorvíveis sintéticos, apresentaram o mesmo tipo de adesão quando testados como suportes para cultura de células Vero (SANTOS JR et al., 2001, 2004). De acordo com a literatura, a adesão lenta favorece a liberação antecipada de componentes da matriz celular, que estimulariam a proliferação das células (MANN et al. 1999).
Quanto à morfologia, em todos os suportes de cultivo utilizados neste estudo as CTMs preservaram as características morfológicas in vitro descritas na literatura (CASTRO et al., 1980; FRIEDENSTEIN, 1992; GRONTHOS et al., 2003; KASSEM et al., 1993; LURIA et al., 1971). Por sua vez, as células cultivadas sobre o biopolímero apresentaram maiores projeções citoplasmáticas e conexões entre elas. Em estudo com PLLA modificado, aconteceu um aumento da interação entre as células, o que significaria um contato direto melhor com a superfície do material (LIU; WON; MA, 2006).
As CTMs utilizadas neste estudo, após a imunofenotipagem, apresentaram-se marcadas positivamente para os anticorpos CD29 e CD44, que podem ser associados com a adesão e espraiamento celular (DE UGARTE et al., 2003; LEE, J. W. et al., 2004); e foram negativas para os marcadores CD34 e CD45, demonstrando que não são de origem endotelial e hematopoiética (PITTENGER et al., 1999). Essas células também apresentaram a capacidade de diferenciação osteogênica, assim como adesão ao plástico, requisitos preconizados pela The International Society for Celullar Therapy para a caracterização das CTMs.
Os suportes para crescimento das células podem ser configurados de maneira fechada ou aberta. Os suportes fechados criam um microambiente para o crescimento das células implantadas e as protegem do reconhecimento e agressão do sistema imunológico; os suportes abertos permitem a incorporação de novas células ao tecido, estimulando a reparação tecidual. Para evitar qualquer processo de rejeição, o ideal seria associar os suportes abertos a drogas imunossupressoras ou a células autólogas (WILLIAMS, 1999).
CARVALHO, C. L. DISCUSSÃO 49
As CTMs são conhecidas por participarem da regulação do sistema imune e pela baixa imunogenicidade (LE BLANC et al., 2003). Em virtude disso, são propostas como uma alternativa viável para terapêutica de desordens imunológicas (LAAR; TYNDALL, 2006) e para o transplante autólogo ou alogênico (CHAMBERLAIN et al., 2007). Ou seja, a aplicação das CTMs em combinação com o biopolímero de cana-de-açúcar para a engenharia tecidual poderia não exigir a utilização de drogas imunossupressoras pelo paciente e permitiria o emprego de CTMs provenientes de outro doador humano.
As características das CTMs as tornam uma fonte celular promissora para a engenharia tecidual. As CTMs têm a propriedade de diferenciação em distintas células específicas do tecido mesenquimal, por isso são aplicadas para a produção de células da cartilagem, músculo, medula óssea, tendão e outros tecidos conectivo. Essas células também secretam uma grande variedade de moléculas bioativas que podem regenerar o microambiente tecidual na área da lesão. Assim, as CTMs podem ser usadas para reparar defeitos no tecido mesenquimal, utilizando-se os princípios e práticas da engenharia tecidual (CAPLAN, 2007).
Na engenharia tecidual, as CTMs são as células de escolha para pesquisas que têm o objetivo de reparar defeitos na medula óssea. As linhas de pesquisas avançam na criação in vitro de tecidos que possam aumentar a osteogênese no sítio do defeito medular ou no transplante direto das CTMs sobre suportes biodegradáveis devido ao papel dessas células na formação da matriz extracelular (FRÖHLICH et al., 2008). Analisamos o potencial de diferenciação em osteoblastos das CTMs sobre os suportes de biopolímero de cana-de-açúcar durante duas semanas de indução osteogênica. O gel de biopolímero sustentou a diferenciação e as células foram coradas pelo método de von Kossa para evidenciar os depósitos de cálcio em escuro.
Os biomateriais devem apresentar cinco propriedades para a aplicação na engenharia tecidual: biocompatibilidade, capacidade de suportar o crescimento celular, orientar e organizar as células, possibilitar a proliferação celular, ao mesmo tempo em que mantém a difusão de fatores de crescimento e resíduos, e por último, quando a função tecidual estiver restabelecida, deve ser degrado sem provocar efeitos colaterais (WILLIAMS, 1999).
CARVALHO, C. L. DISCUSSÃO 50
Dessa forma, os materiais utilizados na engenharia tecidual têm de ser capazes de prover uma matriz extracelular para as células in vivo (WILSON et al., 2005), até que uma nova matriz do tecido de implantação seja formada, porém a interface célula-biomaterial in vitro discrepa do microambiente do local de implante (GROSSKINSKY, 2006). Assim, estudos in vivo são imprescindíveis para investigar a influência do microambiente tecidual sobre o comportamento do biopolímero como matriz extracelular.
O tipo de cultura que apresentamos neste trabalho, pode limitar a abordagem da morfologia celular e das interações célula-célula e matriz-célula, além de restringir a difusão de nutrientes, oxigênio e metabólitos. O desenvolvimento de dispositivos tridimensionais é importante para evitar esses efeitos (FRÖHLICH et al., 2008). Logo, novas abordagens que possam utilizar a cultura tridimensional poderiam ser realizadas com o biopolímero de cana-de-açúcar e as CTMs, visando uma compreensão mais aprofundada quanto à plasticidade dessas células e suas interações com os novos suportes do biomaterial em questão.
CARVALHO, C. L. CONCLUSÕES 52
8 CONCLUSÕES
1. O isolamento e cultivo das CTMs foram estabelecidos. Este resultado propõe que esse é um procedimento reprodutível.
2. As CTMs aderiram e proliferaram sobre os suportes de biopolímero de cana-de-açúcar e a gelatina porcina, controle. Estes resultados sugerem que o biopolímero pode suportar o cultivo das CTMs, exibindo propriedades para aplicação na engenharia tecidual.
3. O estudo dos aspectos morfológicos evidenciou que a cultura das CTMs sobre o gel de biopolímero e membranas de cana-de-açúcar apresentou características similares de cultivo as relatadas na literatura, sendo observado um aumento das interações celulares entre as CTMs no gel de biopolímero. Este resultado indica que existe um favorável contato entre as células e o gel de biopolimero.
4. As CTMs quando cultivadas sobre o gel de biopolímero de cana-de-açúcar e a gelatina porcina sofreram a diferenciação osteogênica comprovada através da coloração com von Kossa. Este resultado sugere que o gel de biopolímero pode servir como suporte para a manutenção das CTMs e diferenciação celular in vitro.
CARVALHO, C. L. PERSPECTIVAS 54
9 PERSPECTIVAS
1. Cultivar as CTMs em dispositivos tridimensionais do gel de biopolímero de cana-de-açúcar;
2. Realizar análises morfológicas específicas para detectar a interação célula- célula e célula-suporte em dispositivos tridimensionais do gel de biopolímero de cana-de-açúcar;
3. Analisar a diferenciação das CTMs em outras linhagens mesodérmicas sobre o suporte do biopolímero de cana-de-açúcar;
4. Realizar estudo in vivo para analisar a aplicação do biopolímero de cana- de-açúcar associado às CTMs na engenharia tecidual.
CARVALHO, C. L. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 54
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