Os biossurfactantes, sem dúvidas estão atraindo muita atenção da economia mundial, uma vez que eles representam uma alternativa ecológica para os surfactantes de origem sintética, pois apresentam menor toxicidade e usam fontes renováveis de substratos para sua produção. Dentre os biossurfactantes, o RL é apontado com o mais promissor, no entanto até presente momento não há nenhum processo em escala industrial para produção eficiente e economicamente viável deste composto (VANAVIL et al., 2013).
Os RLs são produzidos por um pequeno número de empresas, como Jeneil Biosurfactant Company (JBR products) e Rhamnolipid, Inc. Porém, mesmo essas empresas nem sempre têm o produto prontamente disponível para a venda, o que configura a natureza tênue de sua disponibilidade comercial (NITSCHKE et al, 2007).
As pesquisas envolvendo os RLs tiveram diferentes focos ao longo dos anos. Entre os anos de 50 e 60 do século passado, os estudos se concentraram em caracterizar a secreção de RL em P. aeruginosa. Já nas décadas de 60 a 80 os pesquisadores se voltaram para a identificação das vias de produção e forma estrutural, sendo em 1964 isolado o di-RL e em 1971 o mono-RL. Na década seguinte, houve uma maior preocupação em se desenvolver processos de otimização da produção. Os dez últimos anos do século XX tiveram seu foco na biossíntese de RL, sua função no mecanismo de captação de hidrocarbonetos e de seu impacto como fator de virulência. A partir de 2000, os estudos se focaram em outras funções exercidas pelos RL e no estabelecimento de novos métodos mais eficientes de produção (CHRZANOWSKI et al, 2012).
Estudos recentes têm se concentrado na produção destes compostos, a partir de substratos renováveis, bem como em estratégias de engenharia metabólica e melhoramento de cepas para aumentar o fluxo metabólico para sua produção (REIS et al., 2013). O desenvolvimento de tecnologias de produção de baixo custo concomitante a alta produtividade permitirá que essas moléculas se tornem competitivas com tensoativos sintetizados via rota química.
Engenharia metabólica utilizada em outras espécies de Pseudomonas vem sendo relatada para a otimização dos processos de produção de RL (GEYS et al., 2014). Na maioria dos estudos que realizaram a expressão heteróloga dos genes que codificam a via sintética de RL, usaram cepas hospedeiras que eram resistentes a altas concentrações deste composto. Valendo-se deste método, cepas de P. putida foram testadas. Oschner e colaboradores utilizando a cepa KT2442 obtiveram títulos máximos de 0,6g/L, enquanto o maior título de produção de RL em P. putida foi com a cepa KT2440, produzindo aproximadamente 7g/L de mono-RL em um trabalho realizado por Wittgens (GEYS et al., 2014, OCHSNER et al., 1995, WITTGENS et al., 2011). Essa menor produção em comparação com a P. aeruginosa, que apresenta títulos de produção maiores que 100g/L, pode ser explicada devido a insuficiente disponibilidade do percussor dTDP-L-ramnose, um substrato necessário para a atuação das enzimas ramnosiltransferases (CHA et al, 2008, OCHSNER et al., 1995, WITTGENS et al., 2011).
Quando utilizada a mesma estratégia de inserir o operon rhlAB em Escherichia coli nas cepas W2190 e BL21, foram obtidos os títulos máximos de produção de RL de 0,18g/L, sendo mais uma vez sugerido que a disponibilidade de L-ramnose era muito baixa para garantir maiores títulos de produção (CABRERA-VALLADARES et al., 2006, WANG et al., 2007). Cabrera –Valladares realizaram ainda um estudo comparativo entres cepas de E. coli quando expressava tanto o operon rhlAB quanto rmlBDAC. A produção de RLs foi duas vezes maior quando expressava os dois operons, corroborando a hipótese que a disponibilidade L- ramnose afeta diretamente a produção de RLs (CABRERA-VALLADARES et al., 2006).
Até o presente não foi descrita na literatura um método eficaz de produção industrial de RLs. Dessa forma este estudo propôs, pela primeira vez, estratégia de engenharia metabólica para o desenvolvimento de cepas recombinantes de S. cerevisiae para aumentar o rendimento e a produtividade de RLs. O foco na utilização desta levedura como uma ferramenta biotecnológica vem aumentando cada vez mais devido a disponibilidade da sequência de seu genoma completo. Além disso, alterações genéticas dirigidas são facilmente obtidas, uma vez que sua fisiologia e sua genética são bem caracterizadas, o que facilita e acelera os processos de engenharia metabólica (OSTERGAARD et al., 2000). Ademais, tendo como o objetivo minimizar os custos de produção, sugere a utilização de sacarose como fonte de carbono, um produto que é
altamente disponível no Brasil devido ao tamanho e força das culturas de cana-de- açúcar existentes no país. Sendo assim, este estudo prevê uma metodologia inovadora para a produção de RLs. Os resultados obtidos até o momento são de grande importância para o alcance da produção deste composto em larga escala.
Este estudo se concentrou na construção de sete plasmídeos para a expressão tanto de L-ramnose quanto de RL. Nesta etapa foram revisados na literatura os genes descritos como participantes da via de biossíntese destes dois compostos. As sequências dos genes foram retiradas de um banco de dados enzimáticos e enviadas para uma empresa especializada, de forma que suas sequências fossem otimizadas para a expressão em S. cerevisiae, uma vez que esta não produz nenhum destes compostos. A escolha dos genes foi baseada nos microrganismos que os produzem em maiores concentrações, sendo então escolhidos seis genes descritos em P. aeruginosa, quatro deles identificados na via de biossíntese de L-ramnose e dois na via de conjugação de L- ramnose com a cadeia de ácido graxo. O último gene selecionado foi descrito em Pelomanas sacchrarophila, este, por sua vez, capaz de sintetizar a enzima sacarose fosforilase, a qual irá realizar a quebra do substrato intracelular aumentando assim a disponibilidade de glicose para a produção de L-ramnose.
Estes genes foram clonados em sete plasmídeos de expressão em levedura para a formação de cassetes de expressão, sendo estes compostos por promotor-gene- terminador, posteriormente estes cassetes foram subclonados para a formação de três plasmídeos finais, um com três genes e dois plasmídeos contendo dois genes. Estes plasmídeos serão clonados na levedura S. cerevisiae, inicialmente, para detecção de L- ramnose, que após confirmação da expressão, será acrescentado o plasmídeo com os genes responsáveis pela conjugação do açúcar com a cadeia de ácido graxo.
Até o momento, os sete genes estão clonados em seus respectivos plasmídeos de expressão em levedura, as construções foram confirmadas por meio do método de restrição nucléica, como indicado nas figuras 10 e 11. As subclonagens também foram realizadas, sendo confirmada a construção do plasmídeo final p425GPD com os genes das enzimas sacarose fosforilase, rmlA e rmlC, que irão compor a via de biossíntese da L-ramnose, este plasmídeo final foi confirmado por meio do método de PCR, com indicado na figura 12.
Além disso, em colaboração com a Universidade Chalmers University Technology na Suécia, foi realizado o sequenciamento do plasmídeo final, confirmando a construção desse vetor. Foi também confirmada a construção do plasmídeo p424 ADH com os genes rhlA e rhlB. Pelo método de PCR foram identificados os tamanhos dos respectivos cassetes de expressão (Figura 14), compondo assim o plasmídeo final para a produção de mono-RL.
O plasmídeo final p426GPD com os genes rmlB e rmlD foi o primeiro plasmídeo final a ser construído, no entanto, quando enviado para o sequenciamento não foi confirmado a clonagem do gene rmlB, retornando a clonagem para etapas iniciais. A repetição da clonagem do gene rmlB no plasmídeo p426GPD já foi realizada e confirmada por meio do perfil de restrição como observado na figura 10. Segue-se com a construção do final com o cassete do gene rmlD.
Com a confirmação da construção p425GPD com os genes da sacarose fosforilase, rmlA e rmlC foi realizada uma transformação da levedura S. cerevisiae, sendo realizada um PCR de colônia para confirmação da clonagem. Neste PCR foi confirmada uma colônia transformante. Após a confirmação da construção do plasmídeo final p426GPD com os genes rmlB e rmlD será realizada uma nova clonagem de levedura com esse plasmídeo para seguir-se com os ensaios de detecção de L-ramnose.