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O citrato de sódio, descoberto na década 1920, inicialmente era usado como anticoagulante na terapia de transfusão de plaquetas, contudo, o seu uso, tinha algumas limitações. Constatou-se que concentrados de plaquetas preparados com citrato eram inadequados para transfusão, por causa da agregação plaquetária. Após alguns estudos descubriu-se que reduzindo o pH do PRP anticoagulado com citrato, diminuia a agregação. Esta descoberta levou ao desevolvimendo do ácido cítrico/ citrato de sódio/ dextrose (ACD), que seria usado como um novo tipo de anticoagulante (Aster R.H. 2013).

A heparina (Hp), o citrato de sódio (CIT) foram os primeiros anticoagulantes usados em humanos, seguidos pelo EDTA e ACD. No final da década de 50 e início da década de 60, o uso do EDTA como anticoagulante para o preparo do PRP já era conhecido. Na época, milhares de concentrados de plaquetas com EDTA foram coletados e transfundidos (Aster R.H. 2013).

A seguir são descritas as principais características físico- químicas dos principais anticoagulantes usados na terapia de transfusão de plaquetas:

 O CIT é um sal orgânico, quimicamente definido como base conjugada do ácido cítrico, o qual é um ácido fraco. A sua ação como anticoagulante se deve a reação do íon citrato com o íon cálcio presente no sangue, formando um sal insolúvel que bloqueia a cascata de coagulação de forma reversível.

 A Hp é um polissacarídeo sulfatado, hidrossolúvel e termoestável presente naturalmente nos pulmões, fígado, pele e mastocitos dos mamíferos em geral. A sua ação é atribuída ao grupo sulfato presente na molécula, que inibe a formação e a ativação da protrombina, interferindo na formação da tromboplastina e na fase de conversão do fibrinogênio em fibrina. A Hp atua tanto in vivo como in vitro e possui um alto potencial anticoagulante, para 100 mL de sangue são necessários apenas 1 mg do anticoagulante (Harper H. A. 1971). Para neutralizar o efeito anticoagulante da heparina utiliza-se protamina, sob a forma de sulfato ou cloridrato, na proporção 1:1.

 O EDTA é um composto orgânico que além de ser um poderoso antioxidante, age como agente quelante formando complexos muito estáveis com diversos íons metálicos, dentre eles o íon cálcio (Rosenblum W. I. 1968).

 O ACD é uma solução contendo citrato de sódio, ácido cítrico e dextrose, além que possuir o mesmo mecanismo de ação do CIT, o ACD acidifica o sangue. A dextrose presente no ACD ajuda na preservação das células, além de considerado um importante intermediário metabólito para produção de energia celular.

Atualmente, os anticoagulantes mais usados na preservação e armazenamento do sangue humano e seus derivados são heparina, citrato de sódio e ACD-A. O EDTA e oxalato de sódio (OXA) estão em desuso por serem considerados citotóxicos, principalmente este último, por ser sintetizado a partir de um ácido extremante tóxico, o ácido oxálico. No entanto, o EDTA, é o anticoagulante preferido para exames hematológicos, devido a sua maior eficiência, se comparado com outros anticoagulantes existentes no mercado. Contudo, estudos desmostraram que o sangue anticoagulado com EDTA e armazenado a temperaturas inferiores a 37°C, causa alterações conformacionais na glicoproteína IIb presente nas plaquetas, levando a sua agregação, o que resulta numa contagem plaquetéria extremamente baixa (Stokol T. et al. 2007; Zucker M.B. et al. 1954).

Atualmente, o ACD-A tem sido utilizado preferencialmente como anticoagulante na obtenção do PRP, uma vez que mostra uma grande eficiência na preservação das células do sangue e na manutenção do pH fisiológico. Além de evitar a agregação irrevesível das plaquetas e preservar sua morfologia discóide (Aster R.H. 2013; Lei H. et al. 2009).

Os anticoagulantes que interferem no pH do sangue e acidificam o meio, altera a adesividade das plaquetas, evitando sua agregação e posterior ativação. Este efeito pode ser explicado por três mecanismos: as plaquetas em pH baixo são menos sensíveis a agregação induzida por trombina; o pH ácido pode reduzir o metabolismo de ATP dentro das células, resultando em uma menor liberação de ADP (adenosina difosfato), o que afeta diretamente a liberação de energia necessária para as reações bioquímicas da coagulação; e finalmente, a mudança no pH pode afetar forças eletrostáticas na superfície da membrana celular das plaquetas, impedindo sua agregação (Flatow F.A. Jr. et al. 1966; Aster R.H. 2013).

Apesar dos benefícios, os anticoagulantes podem provocar alterações na morfologia das células sanguíneas, principalmente nas plaquetas e nas células vermelhas, prejudicando a qualidade do sangue ou seus derivados.

Estudos realizados por Zucker M. B. et al. (1954), constataram que o citrato e o oxalato alteram a morfologia das plaquetas, porém em menor proporção que o EDTA. Eles demonstraram que o CIT e o OXA alteraram apenas 15% das plaquetas, enquanto que o EDTA deformou a maioria das plaquetas e danificou a membrana celular, resultando em plaquetas esféricas e com aparência irregular (Aster R.H. 2013).

Com relação ao efeito dos anticoagulantes na morfologia de células vermelhas (RBCs) este foi estudado por Rosenblum W.I. et al. (1968). Estes autores constataram que existem dois grupos de anticoagulante, os que encolhem as RBCs, modificando sua morfologia (CIT e OXA), e aqueles que não modificam seu tamanho ou forma (Hp, EDTA e ACD-A). Eles observaram também que a mudança na morfologia afeta diretamente a viscosidade do sangue. No caso do CIT e OXA, houve um aumento na viscosidade do sangue sem nenhum efeito sobre a viscosidade do plasma. Enquanto que com EDTA, ACD-A e Hp não foi observada qualquer influência sobre a viscosidade do sangue nem do plasma.

A temperatura em que o sangue anticoagulado ou PRP são armazenados também é importante. Zucker M. B. et al. (1954) e Han P. et al. (1974) observaram que as plaquetas armazenadas em temperaturas menores que 37ºC podem sofrer alterações morfológicas e fisiológicas, além de agregarem de forma espontânea. Zucker constatou que no sangue coletado com CIT a 23,5ºC, aproximadamente 70% das plaquetas se encontram na sua forma natural, 20% na forma esférica e 10% com conformação indefinida. Já Han observou que as plaquetas armazenadas à temperatura ambiente são mais sensíveis ao ADP e à trombina do que a 37°C, e que essa sensibilização a temperaturas mais baixas pode mascarar as diferenças entre os anticoagulante.

O'Brien J. R. et al. (1969) também estudou o efeito dos anticoagulantes na agregação plaquetária. Estes autores avaliaram a influência de CIT e Hp, em diferentes concentrações, na agregação e na sua ativação pela adição de adenosina difosfato, adrenalina e/ou colágeno. Eles constataram que com CIT as plaquetas se agregam

mais facilmente. Com Hp isto não ocorre, este não promove a adesão plaquetária. A resposta na ativação com os agonitas testados também foi diferente para os dois anticoagulantes. O que era esperado, porque agem de forma distinta, o CIT é uma substância iônica e a Hp molecular, consequentemente bloqueiam etapas diferentes da cascata de coagulação.

A respeito da influência dos anticoagulantes na separação das células do sangue e na eficiência na obtenção do PRP, estudos realizados por Shimizu T. et al. (1984) com ACD e o CPD (citrato/ fosfato/ dextrose) mostraram que volume de PRP obtido com CPD foi maior (4,0 a 4,5%) em relação ao ACD, dependendo do tipo de recipiente usado na centrifugação. Além disso, o número de plaquetas encontrado no PRP obtido com CPD foi maior que com ACD. Estes autores concluiram que as condições ideais de centrifugação são distintas para cada anticoagulante.

O efeito do anticoagulante no sangue e no PRP também foi estudado em animais por Callan M.B. et al. (2009), estes compararam o efeito do CIT e do ACD-A em cães. Eles constataram uma diferença na contagem das plaquetas no ST, que foi menor no ACD-A, porém não significativa (p<0,05). Com relação ao aspecto físico- químico dos anticoagulantes estudados, o pH do ACD-A era menor (4,9) do que o CIT (7,8). Já a concentração de íons citrato era maior no CIT (24,4mg/mL) do que no ACD- A (15,6 mg/mL). Estas diferenças no pH e na concentração de íons citrato influencio diretamente na agregação e na ativação das plaquetas no PRP.

Eles também demonstraram que a agregação das plaquetas está associada ao sexo do doador, o que pode ser explicado pela menor porcentagem de RBC’s no ST em doadores do sexo feminino, resultando numa quantidade de plasma maior no sangue das fêmeas. Esta diferença faz com que os íons citrato adicionados na ativação do PRP apresentem uma concentração menor no plasma. Ainda, observaram que o pH mais ácido do ACD-A é vantajoso, já que previne a ativação precoce das plaquetas, quando armazenada por um período prolongado. Além disso, esses autores também constataram que alterações morfológicas leves das plaquetas podem ser revertidas pela adição de plasma autólogo.

Em outro estudo feito em cães por Stokol T. et al. (2007), comparou CIT com EDTA. Os resultados mostraram que a precisão da contagem de plaquetas pode ser

sensivelmente afetada pela agregação plaquetária (aglomeração), a qual geralmente diminui a contagem. Acredita-se que a agregação das plaquetas é resultante da sua ativação durante a coleta da amostra, o que pode afetar a contagem de todas as espécies. A ativação pode ocorrer quando o sangue é coletado a partir de pequenas veias periféricas, que tem fluxo sanguíneo lento, pelo colapso com a pressão do vácuo, ou ainda, pela agitação excessiva da amostra durante a mistura. Os resultados indicaram que a contagem plaquetária é significativamente menor no sangue anticoagulado com CIT quando comparado com sangue anticoagulado com EDTA. Este fenômeno também ocorre em amostras de sangue de pacientes humanos, quando colhido e anticoagulado com CIT. Uma explicação alternativa para a diminuição da contagem de plaquetas é o preenchimento incompleto do tubo de coleta, por causa da pressão variável do vácuo, este diluiria o sangue mais do que a proporção de 1:10.

Stokol T. et al. (2007) também observaram que o volume plaquetário médio (VPM ou MPV) foi significativamente maior em amostras de sangue anticoagulado com CIT, que pode ser explicado pela maior freqüência e grau de agregação plaquetária. Outras explicações para a maior VPM no CIT, quando comparado com o sangue anticoagulado com EDTA, é a ativação das plaquetas, que mudam de forma discóide para esferas espinhosas, além de incharem pela absorção de água, e degranulação. Esta hipotese foi respaldada por descobertas em estudos anteriores em humanos e cães, que mostraram o aumento de P-selectina em plaquetas colhidas com citrato.

Capítulo 3 – Conclusões e Sugestões para