Os tecidos animais são compostos por células embebidas em uma matriz extracelular (MEC), e do ponto de vista estrutural a MEC natural é uma rede tridimensional de fibras composta por várias proteínas e polissacarídeos, com diâmetro variando de dezenas a centenas de nanômetros (WANG et al., 2013). Um arcabouço de sustentação ideal deve interagir com as células, apoiar a ligação e proliferação celular e estimular a regeneração dos tecidos. (KHOJASTEH et al., 2015). Vários polímeros biodegradáveis e biocompatíveis, de origem sintética e natural, foram desenvolvidos para aplicações biomédicas. Os poliésteres alifáticos, também conhecidos como poli (ésteres α-hidroxi), são um desses grupos de polímeros bioabsorvíveis e biocompatíveis que têm grande potencial para utilização na regeneração de grandes áreas teciduais. Esta classe de polímeros inclui ácido polilático (PLA), ácido poli-glicólico (PGA), poli-ε- caprolactona (PCL), poli-dioxanona (PDO) e poli-carbonato de trimetileno (NARAYANAN et al., 2016).
O ácido polilático (PLA) foi sintetizado por Carothers em 1932 e é produzido a partir de policondensação de ácido láctico ou pela polimerização de abertura do anel do dímero cíclico lactido (JAMSHIDIAN et al., 2010; LOPES, JARDINI, FILHO, 2012). Como outros poliésteres, o PLA degrada-se por hidrólise não enzimática e os seus subprodutos são eliminados através do metabolismo celular normal (LASPRILLA et al., 2012).
O PLA é um poliéster de ácido lático ou ácido 2-hidroxipropiônico, sendo um dos polímeros mais estudados da classe. Tem sido utilizado em muitas aplicações diferentes na área médica, incluindo engenharia tecidual, suturas reabsorvíveis, materiais dentários, implantes oftálmicos, fixação de fraturas e sistemas de administração de fármacos (RAMOT et al., 2015). O PLA possui quiralidade permitindo que os resíduos de cadeia média existam em três estados nantioméricos, L-lático, D-lático e meso-lático. Destes, os mais utilizados são o poli (L-lático) (PLLA) e o poli (D-lático) (PDLA), respectivamente (NARAYANAN et al., 2016).
Entretanto o PLA também possui algumas desvantagens, incluindo fragilidade excessiva e cristalização lenta, duas propriedades que limitam a sua
utilização em cultura celular. Por conseguinte, o PLA é muitas vezes copolimerizado com outros monômeros, resultando em copolímeros que aumentam a sua processabilidade em produtos ou sua eliminação (TSOU et al., 2015). Outra limitação para aplicação do PLA em um ambiente hidrofílico é a sua superfície hidrofóbica. A hidrofobicidade do PLA também resulta em baixa afinidade celular e pode desencadear uma resposta inflamatória do hospedeiro após o contato direto com fluidos biológicos (GUO et al., 2015; STANKEVICH et al., 2015; MURARIU, DUBOIS, 2016).
Khojasteh et al. (2015) avaliaram a adesão, proliferação e diferenciação de células-tronco da polpa dental humana (hDPSCs) em arcabouços de quatro biomateriais disponíveis comercialmente: SureOss (Aloenxerto), Cerabone (Xenotransplante), PLLA (Sintético), e OSTEON II Collagen (compósito). hDPSCs semeadas em arcabouços de PLLA apresentaram maior proliferação e adesão celular. A avaliação da capacidade de diferenciação osteogênica mostrou um nível elevado de atividade de fosfatase alcalina (ALP) em células cultivadas sobre arcabouços de PLLA e OSTEON Ⅱ Collagen. As imagens de microscopia eletrônica de varredura também mostraram que na presença do arcabouço de PLLA, as hDPSCs apresentavam morfologia arredondada semelhante a osteoblastos.
Gangolli et al. (2018) cultivaram hDPSCs sobre arcabouços de camada dupla fabricados a partir de PLGA (ácido poli láctico-co-glicólico). Os autores observaram que as hDPSCs exibiram características de diferenciação dentinogênica, através da expressão gênica e deposição de material mineralizado na ausência de fatores dentinogênicos exógenos, além disso as células foram capazes de proliferar e penetrar no biomaterial.
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
O presente estudo teve como objetivo avaliar, através de experimentos in
vitro, o efeito de diferentes doses do laser de baixa intensidade (LBI) na
proliferação e viabilidade de células-tronco da polpa do dente decíduo humano esfoliado (SHED) cultivadas em filmes de ácido poliláctico (PLA) bem como o estresse oxidativo induzido nessas células.
2 .2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Avaliar a influência do LBI, aplicado nas diferentes doses de 1, 4,7.5 15, 22.5 e 30 J/cm2, na proliferação, morfologia e inter-relação célula-biomaterial
de SHEDs cultivadas sobre filmes de PLA;
- Avaliar a viabilidade das SHEDs quando submetidas a doses mais elevadas de irradiação (22,5 J/cm² e 30 J/cm2);
- Mensurar o estresse oxidativo induzido nas SHEDs quando submetidas a doses mais elevadas de irradiação (22,5 J/cm² e 30 J/cm2).
3 ARTIGO
BAIXAS DENSIDADES DE ENERGIA DA LASERTERAPIA PROMOVEM AUMENTO DA PROLIFERAÇÃO E VIABILIDADE CELULAR E DIMINUIÇÃO DO ESTRESSE OXIDATIVO EM CÉLULAS-TRONCO DA POLPA DE DENTES DECÍDUOS.
Laura Priscila Barboza de Carvalhoa, Carlos Augusto Galvão Barbozaa
a Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral, Universidade Federal do Rio
Grande do Norte, Natal, RN, Brasil
Autor para correspondência:
Carlos Augusto Galvão Barboza
Universidade Federal do Rio Grande do Norte Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral Av. Salgado Filho, 1787 – Lagoa Nova
CEP 59056-000 – Natal – RN – Brasil e-mail: [email protected]
RESUMO
O objetivo do estudo foi avaliar o efeito de diferentes doses de laser de baixa intensidade (LBI) na proliferação, na viabilidade e no estresse oxidativo em células-tronco da polpa de dentes decíduos humanos esfoliados (SHED) cultivadas sobre arcabouços de ácido polilático (PLA). As células foram cultivadas sobre os arcabouços e irradiadas ou não (controle) com um laser diodo InGaAlP (660 nm, 30 mW, modo de ação contínuo) usando um screening de doses (1, 4, 7.5, 15, 22.5 e 30 J/cm2). A proliferação e a viabilidade celulares
foram analisadas nos intervalos de 24, 48 e 72 h, através dos métodos Alamar Blue e Live/Dead. A morfologia celular foi avaliada por microscopia eletrônica de varredura (MEV) no intervalo de 72h entre os grupos controle, L1, L4, L22.5 e L30. A liberação de espécies reativas de oxigênio (ROS) foi investigada através dos níveis de malondialdeído (MDA) e glutationa (GSH). Nos grupos L1 e L4 evidenciou-se maior densidade celular, elevados níveis de GSH e redução do MDA quando comparados aos grupos que receberam as maiores doses. Por outro lado, doses elevadas do laser (22.5 e 30 J/cm2) resultaram em um efeito
anti-proliferativo e na diminuição da viabilidade celular. Conclui-se que doses baixas de LBI (1 e 4 J/cm²) promovem proliferação de SHEDs em arcabouços de PLA, enquanto doses elevadas (22.5 e 30 J/cm²) promovem ação citotóxica e anti-proliferativa nestas células.
Palavras-chave: Células-tronco. Materiais bioompatíveis. Terapia com laser de
INTRODUÇÃO
As células-tronco da polpa dentária humana (hDPSC) têm sido objeto de pesquisa na área de engenharia tecidual por sua elevada capacidade de auto- renovação e potencial de diferenciação celular, aliados a facilidade de acesso, abordagem menos invasiva para a coleta e bom tempo de sobrevivência celular [1]. Dentre as hDPSCs, as SHEDs (células-tronco da polpa do dente decíduo esfoliado) são uma população celular clonogênica que se destaca por se multiplicarem rapidamente e se diferenciarem em uma ampla variedade de tipos teciduais [2,3]. Acredita-se que estas células representem uma população de células multipotentes que se encontra em um estágio de maturidade inferior ao das hDPSCs [4].
Para que haja neoformação tecidual, as células-tronco necessitam ser cultivadas em um arcabouço (scaffold) - microambiente biomimético favorável - que funciona como um veículo para que células sejam transferidas para a área a ser reparada [1]. Os arcabouços de ácido polilático (PLA) permitem a proliferação, infiltração e diferenciação das SHEDs, além da deposição de matriz [5,6,7].
Entretanto, apesar da facilidade na obtenção das SHEDs, a proliferação dessas células é um processo demorado e torna-se fundamental a utilização de meios que acelerem a expansão celular em um menor intervalo de tempo. Nesse contexto, uma das possibilidades sugeridas na literatura é o uso do laser de baixa intensidade (LBI) [8]. A irradiação com LBI a uma densidade de energia de 0,5 a 4,0 J/cm2 e espectro visível de 600 a 700 nm aumenta proliferação de vários
tipos de MSC, incluindo hDPSC e SHEDs [8,9,10,11,12,13]. Entretanto ainda não está totalmente esclarecido em quais mecanismos moleculares a irradiação atua e qual a dosagem ideal para promover a proliferação celular, sem alterar a viabilidade celular, e a mais adequada para levar a morte celular, no caso da terapia fotoquímica para lesões malignas [12].
O estresse oxidativo causado pelo acúmulo celular de espécies reativas de oxigênio (ROS) é um dos principais contribuintes para a lesão e morte celular. Embora o excesso de ROS seja prejudicial, um certo nível de ROS é necessário
para as funções celulares, incluindo o crescimento, migração e diferenciação celulares [14,15]. O estresse oxidativo decorre de um desequilíbrio na produção de ROS e sua neutralização por sistemas antioxidantes. Tem sido relatado que essas espécies reativas acumuladas durante o estresse oxidativo são transitórias devido à sua alta reatividade, levando ao dano oxidativo de biomoléculas indispensáveis, como proteínas, lipídios e ácidos nucléicos [16,17,18].
Os lipídeos são a classe de moléculas mais sensível aos danos causados pela oxidação por ROS. A degradação dos lipídeos das membranas celulares e seus produtos finais da peroxidação, como o malondialdeído (MDA) e outros aldeídos, são especialmente danosos, podendo reduzir a viabilidade celular [19]. Por outro lado, algumas moléculas atuam na defesa antioxidante do organismo, como por exemplo a gluationa (GSH), presente em todas as células do corpo humano, atuando como cofator de enzimas na destruição de ROS. A GSH também participa do metabolismo dos nutrientes, da regulação de eventos celulares, tais como: apoptose, proliferação, produção de citocinas, resposta imune e síntese proteica. Além disso, o aumento da concentração de GSH nos tecidos previne os danos resultantes do estresse oxidativo, por outro lado sua deficiência está relacionada a uma grande vulnerabilidade do organismo aos efeitos provocados pelo acúmulo de ROS [19, 20, 21].
Até o momento não existem trabalhos que compararam o estresse oxidativo induzido pelo LBI (aplicado em baixas e elevadas densidades de energia) em SHEDs cultivadas sobre arcabouços de PLA, nem o efeito resultante do estresse oxidativo na atividade biológica destas células. Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar, através de experimentos in vitro, a influência de diferentes doses de irradiação com o LBI na proliferação e viabilidade celular e no estresse oxidativo induzido em SHEDs cultivadas sobre filmes de PLA.
MATERIAIS E MÉTODOS
O presente estudo foi aprovado pelo comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (Parecer 787.028). As SHEDs utilizadas neste estudo foram previamente obtidas por de Ginani et al. [22].
Cultivo celular
Após isolamento e expansão, as células foram analisadas na terceira passagem (P3) para confirmar sua natureza de célula-tronco, de acordo com os critérios estabelecidos por Dominici et al. [23]. Em resumo, uma alíquota de células foi avaliada por citometria de fluxo usando Human MSC Analysis Kit (BD Stemflow™, USA) que permite avaliar os marcadores de superfície celular que, em conjunto, identificam as células-tronco mesenquimais através de dois coquetéis de anticorpos para detectar expressões positivas (CD105 PerCP- Cy5.5, CD73APC, CD90 FITC) e negativas (CD45, CD34, CD11b, CD19, HLA- DR PE). Adicionalmente, a natureza multipotencial das SHEDs foi confirmada cultivando as células em meios de diferenciação osteogênico e adipogênico (StemPro® Differentiation Kits, Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA) por até 21 dias. Após esse período, as células foram analisadas em microscopia de luz a fim de visualizar as características morfológicas de células osteoblásticas (deposição de matriz mineralizada) e de adipócitos (vacúolos de lipídios no citoplasma), comprovando a natureza multipotencial dessas células.
Confecção e desinfecção dos filmes de PLA
Os filmes de PLA foram confeccionados no Laboratório de Dispositivos Poliméricos (LADISPO) do Instituto de Macromoléculas Professora Eloisa Mano (IMA) da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), a partir do PLA bruto na forma de pellets (massa molecular 93.156 g/mol; Natureworks, USA), seguindo-se uma adaptação da técnica descrita por Liang et al. [24]. Inicialmente, 2 gramas de PLA foram dissolvidos em 100 mL de clorofórmio em um agitador magnético com temperatura de 60°C durante 90 minutos. Em seguida, o material foi depositado em placas de vidro e mantido em câmara de ventilação durante duas horas para evaporação do clorofórmio residual e, posteriormente, deixado overnight em estufa. Os filmes obtidos foram recortados em fragmentos com o diâmetro adequado para adaptação nas placas de cultivo.
Antes do cultivo, os filmes foram submetidos a três lavagens (2 minutos cada) em solução tampão fosfato (PBS) para remoção de clorofórmio residual e a desinfecção foi realizada através da irradiação por luz ultravioleta por 30 minutos sob fluxo laminar e três lavagens (5 minutos cada) em solução de PBS contendo 4% de antibióticos-antimicóticos (400 IU/mL de penicilina, 400 mg/mL de estreptomicina e 1 µg/ml de anfotericina B; todos da Gibco, USA). Em seguida, os filmes foram submetidos a lavagens em PBS para remoção do antibiótico residual, distribuídos nas placas de cultivo e, com o objetivo de aumentar a hidrofilicidade do biomaterial, foram imersos por 12 horas em meio α-MEM suplementado com 1% de antibióticos-antimicóticos (100 IU/mL de penicilina, 100 mg/mL de estreptomicina e 0.25 µg/ml de anfotericina B; todos da Gibco, USA), a 37 ºC com 5% CO2).
Desenho experimental
Após a caracterização, as SHEDs foram expandidas e divididas em oito grupos (Figura 1) de acordo com a superfície de cultivo e o tratamento utilizado: Grupo (PS): células cultivadas diretamente na superfície plástica de poliestireno das placas de cultivo e não irradiadas (controle de crescimento celular); Grupo (PLA): células cultivadas sobre o filme de PLA e não irradiadas; Grupo (L1): células cultivadas sobre o PLA e irradiadas com uma dose de 1 J/cm2; Grupo
(L4): células cultivadas sobre o PLA e irradiadas com 4 J/cm2; Grupo (L7.5):
células cultivadas sobre o PLA e irradiadas com 7,5 J/cm2; Grupo (L15): células
cultivadas sobre o PLA e irradiadas com 15 J/cm2; Grupo (L22.5): células
cultivadas sobre o PLA e irradiadas com 22,5 J/cm2 ; e Grupo (L30): células
cultivadas sobre o PLA e irradiadas com 30 J/cm2.
Em seguida, as células de todos os grupos foram submetidas a ensaios para avaliar a proliferação, viabilidade celular, morfologia e inter-relação célula- célula/ célula-biomaterial e identificar eventos relacionados a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e à morte celular.
Fig. 1 Desenho experimental do estudo.
Irradiação com Laser de Baixa Potência
Os grupos experimentais L1, L4, L7.5, L15, L22,5 e L30 foram irradiados com um aparelho de Laser diodo InGaAlP (Kondortech – Modelo Bio Wave LLLT Dual, São Carlos, Brasil), com os parâmetros descritos na tabela 1.
Tabela 1. Parâmetros do laser utilizado
Composição InGaAlP
Potência 30 mW
Comprimento de onda 660 nm
Modo de ação Contínuo
Diâmetro da ponta 0,01 cm2
Densidade de energia (dose) Grupo (L1):1 J/cm²; Grupo (L4): 4 J/cm²; Grupo (L7.5): 7,5 J/cm²; Grupo (L15): 15 J/cm²; Grupo (L22.5): 22,5 J/cm² Grupo (L30): 30 J/cm2 Tempo de irradiação 33 s
Modo de aplicação sonda de irradiação perpendicular à placa, a 0,5 cm das células
As irradiações foram efetuadas no tempo 0h e as análises foram efetuadas nos intervalos de 24, 48 e 72h após a primeira aplicação do laser. O plaqueamento celular foi realizado de forma que entre os poços semeados havia um poço vazio, impedindo a dispersão de luz não intencional entre os poços durante aplicação do laser.
Para os ensaios de Alamar Blue e Live/Dead as células foram cultivadas em placas de 96 poços e a sonda de irradiação do laser foi posicionada no centro do poço, entretanto para a avaliação do OS, as células foram cultivadas em placas de 6 poços e a aplicação do laser foi realizada em cinco pontos fixos e distintos em cada poço, a fim de garantir que toda a área do poço fosse irradiada.
Análise da proliferação e viabilidade celular
A proliferação e a viabilidade celular foram avaliadas nos intervalos de 24, 48, e 72h, através dos ensaios de Alamar Blue e Live/Dead, respectivamente. Os dois ensaios foram realizados em placas de 96 poços e a densidade celular foi de 5x103 células por poço, e todos os experimentos foram conduzidos em
Ensaio do Alamar Blue
Foi realizada a análise de atividade mitocondrial para avaliar a proliferação celular através do ensaio de Alamar Blue. Este método quantifica a redução metabólica do Alamar Blue por enzimas mitocondriais, resultando na formação de resorufina que tem cor rósea fluorescente. Decorridos os tempos experimentais, o meio de cultivo dos poços foi removido e foram adicionados a cada poço 100 µL de meio de cultivo contendo 10% de Alamar Blue, seguindo- se da incubação das placas a 37°C em atmosfera úmida com 5% de CO2, por 4
horas, de acordo com o protocolo do fabricante. O meio contendo Alamar Blue foi então transferido para novas microplacas de cultivo de 96 poços e a absorbância das amostras foi medida em um leitor de microplacas (Epoch- Biotech Instruments, USA) nos comprimentos de onda de 570 nm (reduzido) e 600 nm (oxidado). O meio de cultura puro, sem adição de células, foi considerado como branco do ensaio e o meio contendo 10% de Alamar Blue, o controle negativo. A redução do Alamar Blue foi calculada a partir da equação fornecida pelo fabricante.
Ensaio do Live/Dead
A viabilidade celular foi avaliada nos grupos nos grupos PLA, L1, L4, L22.5 e L30, através do ensaio Live/Dead no intervalo de 72 horas. Foi utilizado o
Live/Dead Assay Cytotoxicity kit for mammalian cells (Invitrogen, USA), que
permite a coloração simultânea com calceína-AM (fluorescência verde), que indica atividade de esterase intracelular em células vivas, e com homodímero-1 de etídio (fluorescência vermelha), que indica perda de integridade da membrana plasmática em células inviáveis. Decorrido o tempo experimental, o meio de cultivo foi removido, os poços foram lavados com PBS para eliminar algum meio residual e células não aderidas. Os poços dos grupos foram então incubados com 2 µM de calceína AM (que cora em verde o citoplasma de células vivas) e 4 µM de homodímero de etídio (que cora em vermelho o núcleo de células mortas), por 20 minutos, em ambiente protegido da luz. As amostras foram avaliadas em microscópio de fluorescência (Zeiss Imager A2, Oberkochen,
Alemanha) e obtidas fotomicrografias (n=4) do campo central de cada amostra para avaliação de células vivas e mortas e determinação da viabilidade celular.
Análise da Morfologia Celular
No intervalo de 72 h, a morfologia das células foi avaliada por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Para tanto, os arcabouços foram lavados duas vezes com PBS para remover as células não aderidas, e, subsequentemente, fixados em glutaraldeído a 2,5% tamponado com fosfato a 48ºC durante 12 h. Em seguida, as amostras foram submetidas a processamento por ponto crítico, revestidas com ouro pela técnica do “sputtering” e analisadas em microscópio eletrônico de varredura Hitachi TM300 (Hitachi, Tokyo, Japan). Foram obtidas eletromicrografias com magnificação variando de 100 a 1000x, para avaliação descritiva da inter-relação célula-biomaterial, especialmente o padrão de distribuição das células na superfície dos filmes de PLA.
Avaliação do Estresse Oxidativo
A avaliação do estresse oxidativo foi realizada nos grupos PLA, L1, L4, L22.5 e L30 através das dosagens de glutationa (GSH) e malondialdeído (MDA), seguindo-se os protocolos adaptados de De Araújo Jr et al. [25]. Ambos os experimentos foram feitos em quadruplicata.
Níveis de Glutationa (GSH)
Decorridos 72 horas do tempo de irradiação, as células foram então suspendidas dos arcabouços e foi obtida uma suspensão contendo um homogenizado de células (100 µL de células em 500 µL de EDTA 0,02 M), ao qual foram adicionados 80 µL de ácido tricloroacético a 50% (TCA) e 320 µL de água destilada. Após centrifugação a 5.000 rpm por 15 min a 4˚C, 100 L do sobrenadante foram adicionados a 200 L de tampão Tris 0,4 M com pH 8,9 e
20 L de 5,5'-ditiobis (ácido 2-nitrobenzóico) (DTNB) 0,01 M. A absorbância de cada amostra foi medida em espectrofotômetro a 420 nm e os dados obtidos representam nmol de GSH L de células.
Níveis de Malondialdeído (MDA)
Decorridas 72 horas da irradiação, as células foram suspendidas em tampão Tris HCl 20 mM e picotadas com bisturi por 15 segundos sobre uma placa resfriada. Em seguida, a suspensão foi tratada em um homegenizador automático e centrifugada a 5.000 rpm por 15 minutos a 4ºC. Um volume de 300 L de sobrenadante foi incubado com 750 L do reagente cromogênico 1-metil- 2-fenilindol (Sigma) e 225 L de HCl a 37%, em banho maria (45ºC) por 40 minutos. A solução foi novamente centrifugada a 5.000 rpm por 15 minutos a 4ºC e 300 L do sobrenadante foram então utilizados para determinação dos níveis de MDA em espectofotômetro a 586 nm. Os dados obtidos representam nmol de MDA por L de células.
Análise estatística
Os dados quantitativos não exibiram distribuição normal, sendo então submetidos à análise não paramétrica. A diferença entre os grupos para cada um dos intervalos de tempo estudados foi analisada pelos testes estatísticos de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney, considerando-se um nível de significância de 5% (p<0,05).
RESULTADOS
Caracterização das SHEDs
As células pulpares apresentaram positividade para os marcadores de superfície CD90 (100%), CD73 (98,3%) e CD105 (99,4%). Já para os marcadores CD45, CD34, CD11b, CD19 e HLA-DR, menos de 1% das células foram positivas (Figura 2). A microscopia de luz mostrou a deposição de matriz mineralizada corada por Von Kossa e a presença de vesículas lipídicas coradas por Oil Red O, o que representa, respectivamente, a diferenciação de células osteoblásticas e adiposas (Figura 3).
Fig. 2 (A-D) Análise da expressão dos marcadores de superfície para células- tronco mesenquimais nas SHEDs: (A) CD73; (B) CD90; (C) CD105; (D) Coquetel negativo.
Fig. 3 Fotomicrografias das SHEDs submetidas a diferenciação osteogênica (A; Coloração por Von Kossa, amplificação original x40) e adipogênica (B; Coloração por Oil Red, amplificação original x100).
ANÁLISE DA PROLIFERAÇÃO CELULAR – Ensaio do Alamar Blue
Na comparação do percentual de redução do Alamar Blue entre os grupos PS (poliestireno da placa de cultivo) e PLA (controle de cultivo no biomaterial sem irradiação), não foram identificadas diferenças estatísticas significativas ao longo do experimento (Figura 4), demonstrando que o filme de PLA produzido promove uma superfície adequada para o crescimento das SHEDs.
Fig. 4 Percentuais de redução do Alamar Blue entre os grupos PS (poliestireno da placa de cultivo) e PLA (controle de cultivo no biomaterial sem irradiação). p>0.05 em todos os intervalos; teste de Mann-Whitney.
A figura 5 mostra os percentuais de redução do Alamar Blue no grupo não irradiado (PLA) e nos grupos irradiados (L1, L4, L7.5, L15, L22.5 e L30) ao longo do experimento e as diferenças significativas entre os grupos são identificados