4-2 Renforcement des chaussées à l'aide Géogrille

O cálculo dos fatores de impressão molecular (IFs) tem sido referido como um método rápido e fácil para avaliar as propriedades de ligação dos polímeros molecularmente impressos (Spivak, 2005). Atendendo à heterogeneidade dos locais de ligação que são produzidos na matriz polimérica durante o processo de síntese dos MIPs, em particular nos sistemas de impressão molecular sintetizados pelo método não- covalente, tornou-se crucial proceder à avaliação da capacidade de reconhecimento molecular destes materiais poliméricos de modo a averiguar a utilidade destes adsorventes seletivos para o isolamento/ pré-concentração do analito alvo.

Assim, no presente estudo os sistemas de impressão molecular- dmt-tr-MIP-1 e dmt-tr-MIP-2 e os correspondentes NIPs foram aplicados como fases estacionárias de colunas cromatográficas de HPLC, por forma a avaliar experimentalmente a sua capacidade de adsorção e a especificidade das interações que são estabelecidas entre o dimetoato e os locais de ligação existentes na matriz polimérica.

Com essa finalidade, o primeiro estudo realizado neste trabalho consistiu em avaliar o efeito do uso de diferentes fases móveis, por exemplo em termos de polaridade, no perfil de eluição do analito alvo a partir do sistema de impressão molecular que é utilizado como fase estacionária. Contudo, verificou-se que a capacidade de reconhecimento molecular do dmt-tr-MIP-2 não poderia ser avaliada mediante esta metodologia, uma vez que durante o acondicionamento da respetiva coluna de HPLC a pressão do sistema cromatográfico aumentava drasticamente impedindo a realização do ensaio. O aumento de pressão deve-se a uma enorme variação de volume, fenómeno vulgarmente designado de swelling, que este MIP apresentava, o qual se encontrava fortemente dependente do tipo de solvente utilizado como fase móvel, sendo que o maior aumento de volume foi obtido com o metanol. Provavelmente, este efeito encontra-se associado à excessiva solvatação dos grupos funcionais insaturados que se situam nos locais de ligação presentes neste adsorvente polimérico (Maier et al., 2004).

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Pelo contrário, para o sistema de impressão molecular dmt-tr-MIP-1 verificou-se apenas um ligeiro aumento do seu volume, quando este MIP se encontrava empacotado na coluna cromatográfica, particularmente quando se usou metanol como fase móvel, tendo-se atingido uma pressão máxima de cerca de 320 psi, pelo que foi possível experimentalmente a realização deste ensaio.

Em seguida, para avaliar a capacidade de reconhecimento molecular do dmt-tr- MIP-1 foi necessário proceder-se previamente à otimização das diferentes variáveis que influenciam este estudo, nomeadamente a quantidade de MIP/ NIP utilizada como fase estacionária, a composição da fase móvel, o fluxo, bem como os volumes da solução de dmt e de acetona, de modo a obter um adequado perfil de eluição. A figura 16mostra os diferentes perfis cromatográficos referentes ao dimetoato, obtidos durante a optimização das diferentes fases móveis, utilizando uma coluna cromatográfica de HPLC empacotada manualmente com 300 mg de dmt-tr-MIP-1.

Figura 16. Perfis cromatográficos relativos à eluição do dimetoato da coluna

cromatográfica contendo o dmt-tr-MIP-1 como fase estacionária, mediante a utilização de diferentes fases móveis: (1) acetonitrilo-água (8:2 (v/v)); (2) acetonitrilo; (3) metanol e (4) metanol-água (8:2 (v/v)); fluxo de 0,5 mLmin-1 e deteção λ = 220 nm.

1 3 2 4

minutos

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De acordo com a figura 16 (1 - 4) é possivel verificar que a natureza das diferentes fases móveis utilizadas para eluir o dimetoato influencia diretamente o tempo de retenção do pesticida e a forma dos picos obtidos, dado que as interações que se estabelecem entre os analitos alvo e a fase estacionária (MIP) dependem da polaridade dos solventes utilizados na fase móvel. Mais precisamente, a utilização de acetonitrilo- água (8:2 (v/v)) como fase móvel permitiu a eluição do dmt sob a forma de um pico relativamente simétrico, enquanto que a utilização de acetonitrilo, metanol e metanol- água (8:2 (v/v)) como fases móveis provocaram o aparecimento de uma cauda no pico (tailing) do dmt, resultante do excessivo arrastamento do analito alvo ao longo da fase estacionária. Assim, foi possível concluir que o perfil de eluição mais adequado (Figura 16– 1) foi obtido quando se utilizou uma solução de acetonitrilo-água (8:2 (v/v)) como fase móvel e um fluxo de 0,5 mLmin-1, traduzindo-se no aumento da relação sinal-ruído e na eficiência da coluna. Por observação da figura 16, é ainda notório que os perfis cromatográficos de eluição do dmt das colunas cromatográficas contendo o dmt-tr- MIP-1 como fase estacionária foram sensivelmente mais alargados, comparativamente com os obtidos utilizando colunas convencionais de fase reversa C18. É de referir, que

esta evidência experimental foi também observada por outros grupos de investigação que utilizaram nos seus estudos sistemas de impressão molecular como fases estacionárias de colunas de HPLC (Tang et al., 2008).

Finalmente, para avaliar a eficácia da etapa de síntese do dmt-tr-MIP-1 procedeu-se ao cálculo dos seus fatores de impressão molecular (IF), de acordo com a metodologia descrita na secção 4.3.1. (i). Para atingir este objetivo, foi realizado um estudo detalhado que envolveu o uso de várias fases móveis e diferentes fluxos para calcular os valores referentes aos fatores de retenção (k) para o MIP e para o respetivo NIP. Dado que as colunas de HPLC foram empacotadas manualmente, de modo a corrigir as eventuais variações dos tempos de retenção do dimetoato, recorreu-se à utilização da acetona como marcador de volume morto, de modo a ajustar os valores de k. Os valores experimentais de IF referentes ao sistema de impressão molecular em estudo são apresentados na tabela 10, o ensaio foi realizado em triplicado, sendo que os valores apresentados na tabela correspondem ao valor médio.

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Tabela 10. Fatores de impressão molecular (IF) referentes ao dmt-tr-MIP-1 em função

das condições cromatográficas utilizadas.

Condições Cromatográficas (Fase Móvel; Fluxo) kMIP kNIP IF

CH3CN; 1,0 mLmin-1 0,09 0,25 0,36 CH3CN; 0,5 mLmin-1 0,12 0,24 0,50 CH3CN; 0,3 mLmin-1 0,10 0,18 0,80 CH3CN/ H2O (9:1 (v/v)); 0,5 mLmin-1 0,09 0,10 0,90 CH3CN/ H2O (8:2 (v/v)); 0,5 mLmin-1 0,16 0,15 1,07 MeOH; 1,0 mLmin-1 0,13 0,04 3,25 MeOH; 0,5 mLmin-1 0,03 0,01 3,00 MeOH/ H2O (9:1 (v/v)); 0,5 mLmin-1 0,22 0,17 1,50

De acordo com os resultados apresentados na tabela 10, e tal como era expectável, é notório que a natureza do solvente utilizado como fase móvel bem como o fluxo que é aplicado têm uma enorme influência nos valores de IF determinados experimentalmente. De facto, quando se utilizou acetonitrilo como solvente da fase móvel, verificou-se que o valor de kNIP era superior ao kMIP, e consequentemente

obtiveram-se valores de IF reduzidos (IF < 1). Estes resultados podem ser corroborados com os obtidos num estudo similar, realizado por Lv e seus colaboradores (Lv et al., 2007), os quais obtiveram valores de IF reduzidos quando utilizaram o acetonitrilo como fase móvel. Com o intuito de retardar a eluição dos analitos alvo e, estudar de que forma este parâmetro, influencia o fator de impressão molecular, reduziu-se o fluxo para 0,5 mLmin-1 e de seguida para 0,3 mLmin-1, o que se traduziu num aumento dos valores de IF (0,5 e 0,8, respetivamente). Por outro lado, a aplicação da mistura de solventes CH3CN/ H2O (8:2 (v/v)) como fase móvel e um fluxo de 0,5 mLmin-1 levou à

obtenção de um valor de IF de 1,07, uma vez que a água retardou a eluição do dimetoato, permitindo obter valores de kMIP superiores. Tal facto já havia sido

verificado aquando da utilização da mesma mistura de solventes (CH3CN/ H2O (9:1

(v/v)), embora numa diferente proporção, verificando-se um aumento do valor de IF (0,9), contudo não tão acentuado, demostrando o efeito da adição de água ao solvente

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orgânico. Finalmente, a utilização de metanol aumentou significativamente os valores de IF, permitindo obter em todos os ensaios valores de kMIP superiores aos de kNIP,

embora os valores de IF tenham sido inferiores quando se experimentou a mistura metanol água. Em suma, os valores de IF mais elevados, de 3,25 e 3,00 foram alcançados quando se utilizou o metanol como solvente da fase móvel e um fluxo de 1,0 e 0,5 mLmin-1, respetivamente. No entanto, os valores de IF obtidos no presente trabalho são relativamente baixos quando comparados com alguns resultados descritos noutros estudos (Lv et al., 2007; Lv et al., 2008). Em particular, no trabalho experimental dirigido por Lv juntamente com a sua equipa de investigação (Lv et al., 2007), foram testados diversos MIPs como fases estacionárias de colunas de HPLC, os quais foram sintetizados utilizando diferentes monómeros funcionais, sendo que o MBA foi aquele que apresentou resultados mais promissores, com valores de IF de 7,9. Neste estudo, os MIPs em análise foram empacotados em colunas cromatográficas de 100 mm de comprimento e 4,6 mm de diâmetro interno e os valores de IF variaram na gama de 3,3 - 7,9 (Lv et al., 2007). Assim, um dos fatores que também contribuiu para a obtenção de baixos valores de IF é o facto de, no âmbito do trabalho realizado nesta dissertação, se ter utilizado colunas de dimensões relativamente reduzidas (50 mm x 4,6 mm DI) para o empacotamento dos sistemas de impressão molecular (MIP/ NIP) promovendo, desta forma, uma eluição muito rápida do dimetoato e, a consequente, obtenção de valores de retenção muito próximos para o MIP e correspondente NIP.

Como ilustrado na figura 17, o perfil de eluição do dmt no sistema de impressão molecular em estudo permitiu ainda inferir o grau de retenção do analito e a especificidade da interação dmt-matriz polimérica (MIP/ NIP), tendo-se observado perfis cromatográficos diferenciados para o MIP e o NIP sendo de salientar que, no caso do MIP, foi obtido um pico cromatográfico alargado e bastante arrastado (Figura 17 - b) comparativamente com o obtido para o NIP. No entanto, este tipo de perfil cromatográfico é característico da presença de locais de ligação no MIP para o pesticida alvo. Assim, por observação da figura 17, foi possível verificar que existe uma maior capacidade de retenção para o dmt por parte do MIP, uma vez que as moléculas do pesticida são mais fortemente retidas nesta matriz polimérica o que advém do processo de impressão molecular, levando à obtenção de um fator de retenção mais elevado. Por outro lado, e tal como esperado, o NIP possui uma reduzida capacidade de

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reconhecimento molecular para o dmt e, portanto, este pesticida é facilmente eluído pela fase móvel aplicada durante o ensaio de avaliação cromatográfica.

Figura 17. Perfis cromatográficos correspondentes à eluição do dimetoato na coluna

cromatográfica empacotada com (a) NIP e (b) MIP. Condições cromatográficas: fase móvel – MeOH, fluxo - 1 mLmin-1 e deteção λ = 220nm.

Os MIPs são considerados recetores sintéticos possuindo uma intrínseca seletividade e especificidade para um dado analito alvo, a qual é conferida através do uso da tecnologia de impressão molecular. Assim, pode concluir-se com este estudo que o sistema de impressão molecular dmt-tr-MIP-1 apresenta capacidade de reconhecimento molecular para o dmt a qual se reflete, em termos moleculares, no estabelecimento de ligações de hidrogénio e de interações hidrofóbicas entre este pesticida e os locais de ligação presentes na matriz polimérica contribuindo para a retenção do pesticida em estudo.

A estratégia que contempla a utilização dos polímeros molecularmente impressos como fases estacionárias de colunas de HPLC para avaliar a sua capacidade de reconhecimento molecular tem sido aplicada com sucesso em vários trabalhos de investigação (Tamayo et al., 2005; Lv et al., 2007; Guzzella et al., 2008; Lv et al., 2008; Michailof et al., 2008), por ser um método relativamente expedito para estudar as propriedades de ligação destes materiais poliméricos. Contudo, na literatura têm sido relatadas algumas limitação dos MIPs sintetizados pela via de polimerização bulk, fundamentalmente no caso particular dos sistemas de impressão não-covalentes, quando estes são usados como fases estacionárias em colunas de HPLC. Os MIPs produzidos por esta técnica de polimerização, após a sintese, necessitam de ser triturados e peneirados, originando partículas de formas irregulares, o que consequentemente

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constitui uma desvantagem para o adequado empacotamento destes materiais poliméricos nas colunas de HPLC (Lee et al., 2008). Adicionalmente, a heterogeneidade dos locais de ligação, que é característica dos sistemas de impressão não-covalente, pode refletir-se no perfíl cromatográfico do composto em estudo, nomeadamente na assimetria do correspondente pico cromatográfico, bem como no seu alargamento e arrastamento (Kim e Guiochon, 2005).