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Segundo IUPAC, a definição de massa acurada abrange a medição de massas (valor empírico) com erros menores a 5 ppm (MURRAY et al., 2013). Os equipamentos em espectrometria de massas de alta resolução (HRMS), como por exemplo aqueles com analisadores de massas do tipo TOF, Q-TOF ou Orbitrap oferecem além da alta resolução, a alta exatidão de massa necessária para o encontro das massas acuradas (KIND & FIEHN, 2010).
A derreplicação via LC-MS é baseada na determinação das massas
acuradas dos íons pseudomoleculares [M+H]+, [M-H]- ou outras espécies identificadas
de íons. Geralmente apresenta-se como um método bastante sensível, fornecendo resultados confiáveis em uma faixa de massa que vai de nanogramas à fentogramas (10- 9 g – 10- 15 g) (NIELSEN et al., 2011). Neste sistema, os sinais obtidos durante as
análises podem ser facilmente deconvoluídos, o que garante que a técnica de LC-MS
seja adequada à derreplicação de misturas complexas (FUNARI et al., 2012, EL-
ELIMAT et al., 2013).
A correta interpretação dos dados de LC-MS é essencial para a correta atribuição das massas moleculares e subsequente investigação nos bancos de dados disponíveis. O modo de ionização do tipo eletrospray (ESI) é a técnica mais utilizada em espectrometria de massas na atualidade por apresentar alta eficiência na ionização de analitos para a interpretação de resultados. Além dos íons pseudomoleculares, outros tipos de íons podem ser detectados durante uma mesma análise, dependendo da natureza do analito, dos parâmetros internos do equipamento (voltagens e energias aplicadas) e do uso de solventes e aditivos (NIELSEN &
SMEDSGAARD, 2003; NIELSEN et al., 2011).
Tais espécies podem validar a atribuição do íon pseudomolecular, especialmente para compostos lábeis, que fragmentam facilmente e àqueles que formam adutos. Os adutos mais comumente visualizados no modo positivo são os
íons [M+Na]+, [M+NH4]+, [M+CH3CN]+, [M+CH3OH]+ e no modo negativo [M-
H+HCOOH]- , além dos respectivos dímeros e trímeros [2M + H]+, [2M + Na]+,[3M +
H]+, and [2M − H]−. Já as perdas mais comuns provenientes das fragmentações já na
fonte de ionização são as perdas de HCOOH, CH3COOH, uma ou mais moléculas de
H2O, CO e CO2 (WOLFENDER et al., 2010; NIELSEN et al., 2011).
Apesar de bastante informativas, tais espécies podem levar a erros de interpretação (NIELSEN et al., 2005; NIELSEN et al., 2011), levando a falsos resultados quanto à identidade do composto alvo. Por isso, no processo de
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derreplicação, todos os resultados devem ser exaustivamente e criteriosamente avaliados.
A derreplicação pode se tornar uma tarefa bastante laboriosa quando os bancos de dados sugerem muitos candidatos para uma mesma massa. Mesmo que uma análise de um analito seja obtida com exatidão de massa abaixo de 1ppm, as fórmulas moleculares encontradas podem culminar em resultados redundantes, devido a ocorrência de estruturas com mesma fórmula.
Para a superação deste tipo de entrave na identificação metabólica, e exclusão dos candidatos menos prováveis, torna-se útil lançar mão de outros dados espectrais que possam ser obtidos a partir do analito alvo, como por exemplo, dados de UV-vis, MS/MS ou até mesmo o conhecimento taxonômico do organismo
investigado e espécies correlatas próximas (MÅNSSON, 2011; NIELSEN et al., 2011;
EL-ELIMAT et al., 2013).
O uso de experimentos HRMS/MS pode fornecer fragmentos com alta exatidão de massa e assim aumentando as informações estruturais inerentes ao alvo investigado. No entanto é válido que a espectrometria de massas por si só não apresenta-se como um método discriminatório único e inequívoco. Por isso, informações adicionais devem ser exploradas para a exclusão de compostos conhecidos durante o processo.
Comparações de dados de UV podem ser muito úteis, fornecendo indicações a respeito da composição estrutural do metabólito com potenciais cromóforos. Em contrapartida, para compostos não conjugados, este tipo de informação não é relevante e adicionalmente a este fato, dados de UV são raramente completos ou disponíveis pelos bancos de dados, havendo-se a necessidade da
busca de cada informação, uma a uma na literatura (MÅNSSON, 2011).
Neste sentido, o tempo de retenção pode funcionar em complementaridade ao processo de derreplicação, quando padrões encontram-se disponíveis para o estudo, sendo um parâmetro confirmatório inequívoco à identidade dos mestabólitos desconhecidos. Embora o uso de padrões seja extremamente ideal, o acesso a eles é obviamente não factível para a maioria dos compostos microbianos, especialmente quando não há a disponibilidade e acessibilidade de compra ou de um banco de padrões próprio.
Devido à vasta quantidade de dados cromatográficos e espectros de massas adquiridos em estudos metabolômicos, vários e distintos métodos de
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screening informatizados têm sido desenvolvidos e aplicados (FREDENHAGEN et al.,
2005; ROJAS-CHERTO et al., 2012; HORAI et al., 2010; HALABALAKI et al., 2014).
Um dos softwares disponíveis à comunidade científica para a determinação de compostos fúngicos conhecidos, a partir de extratos complexos, trata-se do software
Target Analysis formulado pela Bruker Daltonics (GMBH, 2009),
Tal ferramenta computacional foi desenvolvida para o processamento de análises forenses, de toxinas, drogas, pesticidas e outros compostos de interesse (GMBH, 2009), podendo ser utilizada para o screening de extratos contendo até 3000 compostos baseando-se em parâmetros como exatidão de massa, tempo de retenção e valores de mSigma. Este último trata-se de um fator de classificação desenvolvido pela Bruker Daltonics, no qual avalia através de um score, se o desvio padrão das massas isotópicas medidas estão em concordância com às massas isotópicas teóricas, em perfil e intensidade. O score deve apresentar valores menores a 50 para indicar maior concordância à fórmula molecular proposta pelo banco de dados.
O funcionamento do software se dá através do cruzamento de informações obtidas a partir dos espectros de massas e cromatograma adquiridos para uma amostra alvo, com as informações inerentes aos metabólitos vinculados a um banco de dados utilizado durante o processamento.
Em primeira instância, o programa verifica se há a existência dos compostos pertencentes no banco de dados através da comparação da massa acurada do íon pseudomolecular do metabólito conhecido, via a informação de massa exata do mesmo. Havendo o encontro do íon de interesse, o software então analisa o valor de mSigma para todos os íons encontrados. Caso a biblioteca utilizada apresente tempos de retenção registrados para os compostos de interesse (para o mesmo método cromatográfico) também há o cruzamento e comparação dos valores medidos e teóricos.
Baseado nesses parâmetros, a existência dos compostos de interesse é verificada ou não detectada. Após o processamento pelo programa, é gerada uma lista contendo os resultados do screening para a amostra avaliada como fórmula molecular sugerida, desvios de massa, mSigma, etc (FIGURA 1.12). Como uma das ferramentas do software, também é possível gerar o cromatograma de íons extraídos
(EIC – Extract Ions Chromatogram) para todas os íons detectados e confirmados pela
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A intensidade e a forma das bandas geradas são correspondentes ao score de mSigma obtido após tratamento algorítmico do programa. Com isto, quanto menor o valor de mSigma, mais próxima à intensidade e ao perfil real da banda correspondente no cromatograma de pico base (BPC-Base Peak Chromatogram), do extrato analisado. Como o software não é capaz de gerar um ECI contendo tanto os íons de identificação conhecida pelo cruzamento de dados, como dos íons desconhecidos, o cromatograma de ECI contendo os íons identificados é geralmente sobreposto ao cromatograma de BPC do extrato investigado. Sendo assim, torna-se fácil a visualização as bandas cromatográficas de compostos não identificados, como é o caso das bandas visualizadas na cor cinza, no cromatograma exibido na FIGURA 1.12.
Para a criação de um banco de dados a ser processado e vinculado à análise de um extrato de interesse, não apenas massas exatas ou fórmulas moleculares podem ser utilizadas, mas também pode-se construir listas agrupando grupos taxonômicos, ou conjuntos de classes de metabólitos a partir dos dados gravados em um arquivo Chemfolder®. As listas criadas, a partir do Chemfolder (banco de dados construído) na verdade são convertidos em tabelas do programa Excel (Microsoft®) e deste modo são “lidas”/processadas pelo software Target
Analysis (KLITGAARD et al., 2014).
Embora as ferramentas apresentadas sejam bastante úteis no processo de derreplicação, sua utilização não é comprobatória quanto à identidade dos metabólitos fúngicos, fundamentalmente quando não se tem um banco de dados criado com padrões que confirmem tempos de retenção dos compostos de interesse. No entanto, funcionam como um poderoso guia para a determinação de compostos conhecidos, mesmo que posteriormente seja necessário agregar a derreplicação manual ao estudo, investigando-se parâmetros como perfil de fragmentação e espectro de UV de cada composto.
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Banco de dados In House Antibase 2012 Selecionar e exportar dados de interesse em listas Formatação de listas em formato ExcelUso dos dados formatados pelo software Target
Analysis
Tabela contendo dados de Screening da amostra avaliada
ECI gerado via Target Analysis (bandas cromatográficas coloridas)
FIGURA 1.12 - Esquema do fluxo de trabalho para screening de extratos fúngicos pela aplicação software Target Analysis-Bruker no uso da abordagem de derreplicação. Adaptado de KLITGAARD et al., 2014