4.4.1. RT-PCR
A semelhança estrutural entre as antocianinas estudadas e o E2, ligando natural dos
recetores de estrogénios (ERs), e a sua já descrita atividade estrogénica, permitiu colocar a hipótese de que o efeito antiproliferativo possa ser mediado por um mecanismo antiestrogénico (Schmitt and Stopper 2001).
A ser observado, esse efeito permitirá associar a este tipo de compostos um efeito bifásico caraterizado por um efeito proliferativo (estrogénico) a baixas concentrações e um efeito antiproliferativo (antiestrogénico) a altas concentrações, já anteriormente descrito para outros flavonóides (Zava and Duwe 1997). Enquanto o efeito proliferativo dos fitoestrogénios parece ser mediado via ERs, o efeito antiproliferativo parece envolver mecanismos independentes do ER (Collins-Burow, Burow et al. 2000). De facto um estudo recente descreve a capacidade inibição da viabilidade de células de adenocarcinoma da MDA-MB-231, sem recetores de estrogénios (ER-) de altas concentrações de Dp3glc (Syed, Afaq et al. 2008). Adicionalmente, Schmitt e colaboradores associam atividade estrogénica a antocianidinas (Schmitt and Stopper
Controlo Cy3glc Dp3glc 0 20 40 60 80 100 * % cé lu la s M C F- 7 e m fa se S
2001), o que pode sugerir que estes compostos apresentam um efeito bifásico neste tipo de células.
No sentido de elucidar o mecanismo subjacente ao efeito antiproliferativo observado, uma potencial implicação do recetor de estrogénios foi investigada.
O efeito antiproliferativo observado nas células MCF-7 (ER+) após tratamento com altas concentrações da antocianina Dp3glc, ausente nas mesmas condições para a antocianina Cy3glc, conduziu à avaliação do efeito na expressão do ER-α e ER-β da exposição contínua a 100,0 μM das duas antocianinas durante 48 h.
A expressão das isoformas ER-α e ER-β nas células MCF-7 foi determinada por RT- PCR. A concentração de 100,0 μM foi escolhida uma vez que mostrou, anteriormente, induzir o efeito antiproliferativo máximo de aproximadamente 60% para a Dp3glc. O tempo de tratamento de 48 h foi escolhido tendo como base estudos de avaliação da atividade antiproliferativa pelo método do SRB.
As células MCF-7 expressam ambas as isoformas do recetor após incubação com as antocianinas Dp3glc e Cy3glc (Figura 39). A antocianina Dp3glc não alterou a expressão da isoforma ER-α, no entanto uma ligeira redução da expressão da isoforma ER-β foi observada, embora sem significado estatístico.
Curiosamente, o efeito antiproliferativo de células MCF-7, anteriormente observado com esta antocianina, não foi acompanhado de uma modificação na expressão do ER. De alguma forma estas duas caraterísticas poderão estar relacionadas e poderão indicar que o mecanismo antiproliferativo pode ou não implicar uma ligação direta ao ER. A corroborar estes resultados surge um estudo recente com células MCF-7 sujeitas a uma exposição contínua durante 48 h ao antiestrogénio tamoxifeno, um modulador seletivo do recetor de estrogénios (SERM) usado na terapêutica e prevenção do cancro da mama, o qual não provocou alteração dos níveis de mRNA do ER-α, pelo contrário este antiestrogénio é capaz de estabilizar esta forma nuclear ER- α (Wijayaratne and McDonnell 2001). A Dp3glc pode estar a atuar como antagonista, ligando-se diretamente ao ER e impedindo a ligação de outros compostos com atividade estrogénica.
Outro possível mecanismo atuação da Dp3glc pode ser considerado tendo por base a ativação do ER por sinais extracelulares, na ausência de E2. A ligação de fatores de
crescimento hormonal como o fator de crescimento epidérmico (EGF) a recetores de membrana, podem conduzir à fosforilação por MAPK do ER e à sua consequente ativação (Hall, Couse et al. 2001). Um estudo recente reporta a capacidade da Dp de
inibir o recetor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) e consequentemente as MAPK (Meiers, Kemeny et al. 2001).
Com base nos dados anteriores a Dp3glc pode estar a atuar por inibição da ativação do ER via EGFR.
A Dp contribui para a inibição da carcinogénese por bloquear a ativação da via de sinalização das MAPK, que é necessária para a ativação da AP-1, cuja ativação resulta na transformação de células neoplásicas (Hou 2003). A Dp3glc pode atuar como agente quimiopreventivo por ligação direta ao ER ou por outros mecanismos que podem envolver inibição de MAPK.
Consequentemente o efeito antiproliferativo observado para a Dp3glc pode resultar de uma sinergia entre vários mecanismos, nomeadamente efeito antiestrogénico, indução de apoptose, atividade pro-oxidante, etc. Estudos complementares são necessários para elucidar o(s) mecanismo(s) molecular(es) subjacente(s) ao efeito antiproliferativo observado. GAPDH ER-α Dp3glc Cy3glc Controlo 682 bp → 108 bp → 682 bp → 300/400 bp → GAPDH ER-β
Figura 39. Efeito das antocianinas Dp3glc e Cy3glc na expressão das isoformas ER-α e ER-β em células MCF-7 (ER+) avaliado por RT-PCR. Células MCF-7 foram tratadas com: 0,1 % DMSO (veículo), 100,0 μM de Dp3glc e 100,0 μM de Cy3glc durante 48 h, sendo apresentada uma experiência representativa de três experiências independentes com resultados idênticos. Cada valor representa a média ± EPM (n = 3). A expressão relativa de cada banda (REL) foi normalizada e comparada com a expressão do gene GAPDH para cada amostra. *p < 0,05 (diminuição significativa vs respetivo controlo).
Os resultados documentados na Figura 39, para a antocianina Cy3glc mostram uma redução significativa dos níveis de mRNA da isoforma ER-α (*p < 0,05), quando comparado com a densidade da banda das células controlo. Este decréscimo da expressão do ER-α observado para a Cy3glc pode ser explicado por um mecanismo similar ao já descrito para o 17-β-estradiol. Este ligando natural do recetor de estrogénios é capaz de provocar uma redução dos níveis de mRNA da isoforma ER-α por inibição da transcrição do gene ou por um efeito pos-transcripcional no mRNA do recetor (Saceda, Lippman et al. 1988; Pink and Jordan 1996). Estes resultados estão de acordo com um estudo anterior que reporta a atividade estrogénica da Cy (Schmitt and Stopper 2001).
Adicionalmente, efeitos não genómicos do E2 são atribuídos à ligação a ERs à
superfície das células, podendo a Cy3glc atuar à semelhança deste por ligação a ER de membrana.
O padrão de substituição dos anéis aromáticos das antocianinas pode ter influência na afinidade para o ER-α, sendo que a presença de mais de dois grupos hidroxilo no anel B diminui a afinidade das antocianidinas para o ER-α (Schmitt and Stopper 2001). A
ER- ER- 0 1 2 Dp3glc Controlo Cy3glc * RE L
mesma relação foi observada com outra classe de flavonóides, os flavonóis (canferol, quercetina e miricetina), para os quais a afinidade para o recetor também diminui com o aumento do número de grupos hidroxilo substituídos no anel B (Zava and Duwe 1997). Esta diferente afinidade pode justificar os efeitos antagónicos observados para as antocianinas Cy3glc e Dp3glc.
Por outro lado, um estudo recente reporta a capacidade da Cy de inibir o recetor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) e consequentemente as MAPK (Meiers, Kemeny et al. 2001), podendo o efeito observado resultar do balanço entre dois efeitos opostos.
4.4.2. PCR em tempo real (RT2-PCR)
A avaliação dos níveis de mRNA das duas isoformas do ER após tratamento com as antocianinas Dp3glc e Cy3glc foi também realizada por RT2-PCR. Os níveis de mRNA do ER-α e do ER-β de células tratadas com Dp3glc foram muito semelhantes aos das células controlo (Figura 40). No entanto, os níveis de níveis de mRNA do ER-β de células tratadas com Cy3glc foram significativamente reduzidos (*p < 0,05) em comparação com as células controlo (Figura 40).
Embora ambas as técnicas tenham mostrado um decréscimo na expressão do ER, o tratamento com Cy3glc reduziu seletivamente a expressão do ER-β, não tendo tido qualquer efeito na expressão do ER-α (Figura 40).
De acordo com a literatura o ER-β está associado ao efeito antiproliferativo, podendo antagonizar a função do ER-α (Hartman, Ström et al. 2009). Em células MCF-7, que apresentam predominância do ER-α em relação em ER-β, a redução dos níveis de ER-β induzida pelo tratamento com Cy3glc está associada a um aumento da razão ER-α: ER-β, o que está de acordo com a ausência de efeito antiproliferativo observado para o tratamento com esta antocianina.
Figura 40. Efeito das antocianinas Dp3glc e Cy3glc na expressão das isoformas a) ER-α e b) ER-β em células MCF-7 (ER+) avaliado por RT2-PCR. Células MCF-7 foram tratadas com: 0,1 % DMSO (veículo), 100,0 μM de Dp3glc e 100,0
μM de Cy3glc durante 48 h, sendo apresentada uma experiência representativa de três experiências independentes com resultados idênticos. Cada valor representa a média ± EPM (n = 3). A expressão relativa de cada banda (REL) foi normalizada e comparada com a expressão do gene GAPDH para cada amostra. *p < 0,05 (diminuição significativa vs respetivo controlo).
4.5. Efeito das antocianinas Dp3glc e Cy3glc na expressão proteica de