Pour la recherche de partenaires associées à la protéine hKIN17, nous avons d’abord choisi la méthode GST-pulldown pour isoler les partenaires protéiques associés à chacun des domaines de la protéine (domaines K1 et K2).
J’ai effectué les expériences de mises au point avec le Dr. L. Miccoli au LGR/DRR/CEA Fontenay-aux-Roses. J’ai effectué les expériences de pull-down à grande échelle au laboratoire.
J’ai collaboré avec l’équipe du Dr. J.Chamot-Rooke du laboratoire DCMR de l’Ecole Polytechnique pour les analyses de spectrométrie de masse.
3.1. Mise au point du GST-pulldown avec des extraits marqués
au
35S
Avant de mener des expériences de GST-pulldown à grande échelle, nous avons effectué des essais avec des quantités restreintes d’extraits cellulaires HeLa afin de voir si cette méthode pouvait nous permettre de retenir des partenaires protéiques avec l’un ou l’autre des domaines de hKIN17.
Ces expériences de mise au point ont été réalisées avec des extraits totaux et nucléaires que nous avons nous-mêmes préparés à partir de cellules HeLa en culture comme cela est décrit dans le paragraphe 3.3.2 de la partie Matériel et Méthodes. Les protéines des cellules HeLa ont été marquées radioactivement par incorporation de méthionine marquée au 35S. Le marquage radioactif des protéines permet de travailler avec des petites quantités d’extraits HeLa et de protéines de fusion en étant en même temps très sensible dans la détection des protéines retenues. Ces essais ont été réalisés avec les domaines K1 et K2 en fusion à la GST et avec la protéine GST comme contrôle négatif.
Figure 3-1 : Les billes avec les protéines GST, GST-K1 et GST-K2 après interaction avec les extraits totaux HeLa ou les extraits nucléaires HeLa et après lavage en 300mM NaCl sont déposées sur gel SDS-PAGE et les
protéines marquées au 35S sont révélées au PhosphoImager. Les bandes de protéines marquées par un astérisque
bleu correspondent à des bandes de protéines fortes qui ne sont observées que pour l’une des fusions (GST-K1 ou GST-K2) et pas pour le contrôle GST.
Les profils de protéines des extraits totaux ou des extraits nucléaires de cellules HeLa retenues par les protéines GST, GST-K1 et GST-K2 sont comparés :
- Certaines bandes de protéines sont communes aux puits du contrôle GST et des fusions GST-K1 et GST-K2 (Figure 3-1). Ces protéines doivent correspondre à des protéines liées aux colonnes ou aux protéines de fusion de manière non spécifique.
- Comme cela est mis en évidence sur la Figure 3-1, les protéines de fusion GST-K1 et GST-K2 retiennent des protéines différentes.
- La protéine GST-K2 ne semble pas retenir de protéine supplémentaire lorsque des extraits totaux sont utilisés par rapport à des extraits nucléaires. En revanche, il apparaît que des protéines supplémentaires sont retenues par GST-K1 lorsque des extraits totaux sont utilisés comparativement à des extraits nucléaires.
En conclusion, il semble que des protéines partenaires interagissent spécifiquement avec
chacun des domaines K1 et K2 de hKIN17 et sont donc potentiellement intéressantes à identifier. De plus, le domaine K2 semble avoir essentiellement des partenaires nucléaires alors que le domaine K1 lui aurait plutôt des partenaires nucléaires et cytoplasmiques.
3.2. Pull-down à grande échelle et couplé à l’identification des
protéines par spectrométrie de masse
Afin d’identifier les protéines retenues par les différents domaines de KIN17 par spectrométrie de masse, nous avons reproduit les expériences précédentes avec de plus grandes quantités de protéines de fusion et d’extraits cellulaires HeLa à incuber. On peut s’attendre à ce que, pour une protéine partenaire donnée, le nombre de protéines retenues par les protéines de fusion soit faible par rapport au nombre de protéines dans les extraits car les interactions des protéines de fusion avec les protéines partenaires sont probablement de faible affinité. Par ailleurs, l’identification de protéines séparées sur gel SDS-PAGE par spectrométrie de masse est possible si un minimum de protéines peut être extrait du gel d’autant plus que l’extraction des peptides par digestion à la trypsine dans le gel n’est pas totale.
Sur la Figure 3-2 ci-dessous sont présentés les résultats de trois expériences successives de pull-down avec les domaines K1 et K2 de la protéine hKIN17 en fusion avec une étiquette GST ou ZZ. La plupart de ces essais ont été réalisés avec des extraits nucléaires de cellules HeLa.
Figure 3-2 : En haut, gels des protéines éluées après lavage en 300mM NaCl des billes incubées avec GST ou GST-K1 + extraits total (à gauche) ou nucléaire (à droite) HeLa. Ce sont des gels SDS-PAGE 8% colorés au Bleu de Coomassie pour voir les protéines de grande taille. Les bandes de protéines numérotées ont été analysées par spectrométrie de masse pour identifier les protéines.
En bas, à gauche, les protéines retenues par les protéines GST, GST-K1 et GST-K2 et éluées avec 1M NaCl sont analysées sur un gel SDS-PAGE 8% coloré au bleu colloïdal. Les bandes de protéines notées par une lettre ont été analysées par spectrométrie de masse pour les identifier.
En bas, à droite, les protéines retenues par les protéines GST, GST-K2, ZZ et ZZ-K1 et éluées avec 1M NaCl et les protéines qui restent sur les billes après élution sont analysées sur un gel gradient (Protean II Ready Gel, 10.20%Tris-HCl, Biorad) coloré au bleu colloïdal. Les bandes de protéines numérotées ont été analysées par spectrométrie de masse pour les identifier.
Le premier essai a été réalisé pour rechercher des partenaires du domaine C-terminal de hKIN17 (K1) en fusion à la GST avec des extraits totaux et nucléaires de cellules HeLa commerciaux (Cilbiotech, Belgique) dans les conditions expérimentales déterminées lors de la mise au point du GST pull-down avec les extraits marqués au 35S. En comparant les deux gels de la Figure 3-2-haut, nous voyons les mêmes bandes de protéines assez fortes lorsque les extraits totaux ou nucléaires sont utilisés. Contrairement à ce qui avait été observé précédemment (paragraphe 3.1), la protéine GST-K1 ne semble pas retenir plus de protéines des extraits totaux par rapport aux extraits nucléaires. Dans l’essai suivant, des extraits nucléaires (Cilbiotech) ont été traités à la benzonase avant d’être incubés avec les protéines appât. Ce traitement des extraits par une nucléase pourrait limiter les interactions indirectes, via l’ADN, entre les protéines. Par ailleurs, les protéines retenues par les protéines appât ont été éluées des billes avec 1M NaCl dans le but de s’affranchir des protéines qui se fixeraient sur les billes de façon non spécifique. Globalement, d’après la Figure 3-2-b, la coloration au bleu colloïdal ne permet pas de détecter un grand nombre de protéines retenues par les fusions. Les profils des protéines retenues par la fusion GST-K1 lorsque cette dernière est incubée avec des extraits traités ou non avec de la benzonase diffèrent très peu. Nous avons également effectué le pull-down avec le domaine K1 en fusion avec une autre étiquette (ZZ) comme protéine appât (Figure 3-2-c). Cette autre construction du domaine K1 peut rendre le domaine plus accessible à ses partenaires et les protéines contaminantes retenues par des interactions non spécifiques avec le contrôle (étiquette ZZ sur la colonne IgG) ne sont pas les mêmes que celles retenues par le contrôle GST.
Certaines bandes de protéines des gels de cette Figure 3-2 sont annotées et correspondent à des protéines qui ont été identifiées par spectrométrie de masse au laboratoire DCMR de Polytechnique en collaboration avec l’équipe de Julia Chamot-Rooke. Les protéines ont été analysées par spectrométrie de masse MALDI-TOF et identifiées grâce à l’utilisation des logiciels Profound et/ou Mascot. Les résultats de ces identifications sont répertoriés dans l’annexe 3.
D’après les résultats de l’identification des protéines :
- parmi les protéines identifiées, certaines correspondent à des protéines très abondantes dans la cellule, comme par exemple la cyclophiline, l’ubiquitine, la cofiline, la protéine Ran et doivent plutôt être retenues via des interactions non-spécifiques. Il apparaît également important de séquencer les protéines retenues par les contrôles (étiquette GST ou ZZ) afin d’identifier les protéines contaminantes et non spécifiques.
- les expériences de pull down avec le domaine K1 ont été réalisées avec deux types d’étiquette de fusion (GST et ZZ). Pour l’ensemble des essais effectués, nous observons que le domaine K1 retient peu de protéines des extraits. Les quelques protéines identifiées (la protéine CAD, une protéine de « fusion » qui réalise quatre activités enzymatiques (GATase, CPSase, ATCase and DHOase), la protéine tight junction protein 2 qui joue un rôle dans les jonctions serrées et les jonctions adhérentes et la protéine pyruvate kinase qui intervient dans la régulation de la glycolyse) ne semblent pas avoir de lien fonctionnel avec la protéine KIN17. De manière plus intéressante, parmi les protéines retenues par le domaine K1, nous avons identifié la protéine SmD2, une des sept protéines Sm impliquées dans la formation des complexes de l’épissage, bien que cela puisse paraître surprenant de la trouver isolée des autres protéines Sm.
- nous avons identifié de manière assez sûre, un certain nombre de partenaires potentiels du domaine K2 : le facteur eIF-4A, les protéines p68 et DDX21 appartenant à la famille des protéines DEAD-box, des hélicases de l'ARN.
En conclusion, d’après ces essais de pulldown avec des extraits de cellules HeLa, il
apparaît que la mise en œuvre et l’interprétation de ce type d’expériences restent difficiles et souvent incertaines. Néanmoins, nous pouvons proposer quelques protéines potentiellement associées au domaine N-terminal (K2) de hKIN17. Nous discuterons plus loin (Partie Discussion) des protéines identifiées et du sens que pourrait avoir l’interaction de la protéine KIN17 avec elles. En revanche, cette méthode de pulldown n’a pas permis d’identifier des partenaires du domaine K1, bien que deux types de fusion aient été utilisés. Puisque le domaine K1 en fusion à la GST ou à ZZ a toujours une étiquette de 6 histidines en N- terminal, il serait intéressant d’effectuer deux affinités successives (colonne nickel puis GS4B ou colonne nickel puis IgG) pour augmenter la spécificité d’interaction, comme dans l’approche Tap-Tag (Rigaut et al. 1999; Puig et al. 2001) par exemple qui a fait largement ses preuves.