5-1 Recherche de l’activité antibactérienne 5-1-1 Inocula des bactéries-tests
L’activité antibactérienne des souches actinomycétales isolées est recherchée contre des bactéries-tests qui sont obtenues auprès de l’American Type culture collection (ATCC) et de l’Hôpital Juntendo, Tokyo Japon. Elles sont constituées de bactéries à coloration de Gram positive (Staphylococcus aureus ATCC 25923,
Staphylococcus aureus Mu 50 (résistante à la vancomycine) et Streptococcus faecalis
ATCC 19433) et contre des bactéries à coloration de Gram négative (Escherichia coli ATCC 25922, Proteus vulgaris ATCC 13315 et Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145).
A partir d’une culture de 18 h sur le milieu Trypticase soy agar (TSA), une suspension de chaque bactéries-tests en eau physiologique (0,9 % NaCl) est préparée. La densité cellulaire de chaque suspension est ajustée par dilution dans l’eau
______________________________________________Partie expérimentale physiologique stérile et en comparaison avec la solution 0,5 McFarland (une densité optique égale à 0,2 à 650 nm) de façon à obtenir une concentration finale de 106 UFC/ml après incorporation dans le milieu Mueller Hinton (Cavalla et Eberlin,
1994).
5-1-2 Technique des cylindres d’agar
Les souches d’actinomycètes isolées sont ensemencées en stries serrées sur les milieux de Bennett et GLM et incubées à 28°C pendant 7 jours (Lee et Hwang, 2002).
Des cylindres d’agar de 3 mm de diamètre sont ensuite prélevés à l’emporte pièce et déposés à la surface du milieu de Mueller-Hinton (Merck) préalablement ensemencé par les bactéries-tests. Les boites sont alors placées à 4°C pendant 4 heures, puis incubées à 37 °C pendant 18 à 24 heures. Les diamètres sont alors mesurés.
5-1-3 Technique des puits
A l’aide d’un emporte-pièce, des puits de 3 mm de diamètre chacun sont creusés dans le milieu Muller Hinton préalablement ensemencé par écouvillon selon la technique de la NCCLS avec les microorganismes tests. Une quantité de 20 µ l des surnageants des cultures liquides des Actinomycètes est déposée dans chaque puit. Les boîtes sont laissées à température ambiante pendant 30 minutes, puis incubées à 37°C pendant 18 à 24 heures. Les diamètres d’inhibitions sont mesurés et notés.
5-2 Recherche de l’activité antifongique
L’activité antifongique des actinomycètes isolées est mise en évidence par la technique des cylindres d’agar contre les champignons filamenteux obtenus de l’ATCC et de la collection de l’Unité de Mycologie de l’Institut Pasteur (UMIP) Fusarium
oxysporum UMIP 625.72, Aspergillus fumigatus UMIP 1082.74 et Aspergillus niger
ATCC 16404) et contre les levures Candida albicans UMIP 884.65, Candida albicans UMIP 48.72 et Candida tropicalis R2 UMIP 1275.81 (résistante à l’amphotéricine B et la nystatine) en présence de Streptomyces noursei (NRRL B-1714) et Streptomyces
nodosus (NRRL B-2371) productrices de nystatine et d’amphotéricine A et B
respectivement obtenues auprès de la Northern Regional Research Laboratory (NRRL). L’activité est testée sur le milieu casitone : [Bacto casitone 9 g/L (Difco Laboratories, Sparks, U.S.A.), extrait de levure 5 g/L (Merck), citrate de sodium 10 g/L (Prolabo),
______________________________________________Partie expérimentale sur le milieu YMA : [yeast nitrogen base 6,5 g/L (Difco), asparagine 1,5 g/L (Prolabo), glucose 10 g/L (Merck) et agar 20 g/L (Merck)] (Lemriss et al., 2003). La mesure des diamètres d’inhibition est effectuée après 24 heures d’incubation à 28°C pour les levures et après 48 heures pour les champignons filamenteux.
______________________________________________Partie expérimentale
Identification morphologique, physiologique,
biochimique et moléculaire des souches
______________________________________________Partie expérimentale 1- Etude phénotypique
Les souches actinomycétales représentatives isolées de l’eau de sebkha et du sol de sebkha sont soumises à une étude des différents caractères morphologiques, culturaux, physiologiques et biochimiques dans le but de leur identification.
1-1 Préparation des inocula des souches représentatives 1-1-1 Inoculum général
Les souches d’actinomycetes, conservées sur gélose inclinée de Bennett, sont ensemencées sur milieu gélosé de l’International Streptomyces Project N° 3 (ISP 3) (annexe). Les boites sont incubées à 30° C pendant 14 jours. A partir de ces boites, une suspension dense de fragments mycéliens et de spores est prélevée et introduite dans un flacon contenant de l'eau distillée stérile. Cet inoculum sert à l’ensemencement de tous les milieux utilisés, à l’exception du milieu ISP 9 (annexe) pour lequel on utilise un inoculum lavé (Shirling et Gottlieb, 1966).
1-1-2 Inoculum lavé
Un Erlenmeyer de 250 ml contenant 50 ml de milieu ISP1 (annexe) est inoculé à raison de 10 % (105 spores/ml), puis incubé pendant 72 heures à 30° C avec agitation (180 tr/min). La culture est centrifugée stérilement pendant 10 minutes à 10 000g. Le surnageant est écarté et le culot est lavé deux fois à l’eau distillée stérile puis repris dans 50 ml d’eau distillée stérile. Cette suspension constitue l'inoculum lavé (Shirling
et Gottlieb, 1966).
1-2 Etude morphologique 1-2-1 Caractères culturaux
Les caractères morphologiques et culturaux sont déterminés sur des milieux de culture spécifiques (annexe) : ISP2, ISP3, ISP4 et ISP5 recommandés par Shirling et
Gottlieb (1966), le milieu Amidon-Caseine Agar, le milieu Nutrient Agar, le milieu de Hickey et Tresner, le milieu Glucose Asparagine, le milieu Glucose-Extrait de
Levure-Peptone (GLP), le milieu Sporulation Agar, ainsi que le milieu Czapeck dox Agar. Les milieux sont coulés dans les boites de Pétri 36 heures avant leur utilisation, afin de diminuer l’humidité à la surface de la gélose et de contrôler leur stérilité. Ils sont ensuite ensemencés en stries à partir d’une goutte de l’inoculum déposée en bordure de la gélose. L’évaluation de l’importance de la croissance et du développement du
______________________________________________Partie expérimentale mycélium aérien sur chaque milieu est observée après 7, 14 et 21 jours d’incubation à 30° C.
L’observation de la pigmentation du mycélium secondaire et du mycélium de substrat et la recherche de la présence dans la gélose de pigments diffusibles autres que les pigments mélanoïdes sont réalisées en même temps.
1-2-2 Aspect en microscopie optique
L'observation in situ de la morphologie des chaînes de spores et l’étude du mycélium aérien et du mycélium de substrat ont été effectuées selon la technique décrite par Cross (1989). Cette technique consiste à insérer délicatement une lamelle stérile dans un milieu gélosé (ISP2, ISP3 ou ISP4), de manière à former un angle d’environ 45 degrés. Une goutte de l’inoculum est déposée contre la lamelle en contact avec le milieu nutritif. Après 14 jours d’incubation à 30° C, la lamelle est retirée délicatement de la gélose. Elle est ensuite déposée sur une lame et examinée au microscope (Leica DMLS).
1-3 Etude chimiotaxonomique
Parmi les acides aminés constituant la paroi des actinomycètes, la glycine et l’acide diamino-2,6-pimélique (DAP) sont les marqueurs utilisés pour la classification de ce groupe bactérien. Les sucres caractéristiques des différents types de paroi sont l’arabinose, le galactose et le madurose.
Les différents isomères de l'acide diamino-2,6-pimélique (DAP), les aminoacides et les sucres de la paroi cellulaire sont déterminés par les techniques de Becker et al., (1964) et Staneck et Roberts (1974).
1-3-1 Préparation des cellules
Les mycéliums des souches sélectionnées d’une culture de 4 jours sur ISP1 sont récupérés par centrifugation à 10 000g pendant 20 minutes. Après trois lavages à l’eau distillée, ils subissent un traitement à la potasse éthanolique à 0,5% pendant 24 heures à 37° C. Les cellules subissent alors un lavage à l’éthanol, suivi d’une centrifugation de 15 minutes à 10 000 g puis un séchage à 30° C (Becker et al., 1964).
______________________________________________Partie expérimentale mg de cellules entières (HCL 6 N à 100° C pendant 18 heures) dans un tube scellé (Becker et al., 1965). L’hydrolysat est chromatographié sur couche mince de cellulose dans le système de migration : méthanol-eau-HCl-6 N-pyridine (40 : 13 : 2 : 5 volume/volume). Après séchage le chromatogramme est révélé par pulvérisation d’une solution acétonique à 0,2% de ninhydrine et chauffage à 100 °C pendant 5 minute (Staneck et Roberts, 1974). Les différentes formes de l’acide 2,6-diaminopimélique se caractérisent par une couleur vert olive.
1-3-3 Détermination des sucres
Les sucres de la paroi sont déterminés à partir de l’hydrolysat de 50 mg de cellules entières par l’acide sulfurique 2 N pendant 2 heures à 100° C dans un tube scellé. L’hydrolysat est neutralisé à pH 5.5 avec une solution de Ba(OH)2 en présence de rouge de méthyle comme indicateur de pH. Le précipité de BaSO4 obtenu est éliminé par centrifugation à 15 000 g pendant 10 minutes. Le surnageant est évaporé à sec. Le produit final est dissout dans 0.4 ml d’eau distillée. 0,2 µ l de l’hydrolysat, ainsi que les sucres témoins utilisés (glucose, arabinose, rhamnose et galactose) à 0,1 % (poids/volume) sont déposés sur une plaque de cellulose. Après séchage, une chromatographie ascendante est réalisée dans le système de solvant constitué de n-butanol-eau distillée-pyridine-toluène (10 : 6 : 6 : 1 volume/volume) (Staneck et
Roberts, 1974). Les sucres sont révélés par pulvérisation du réactif d’aniline-acide
phtalique suivie d’un chauffage à 100° C pendant 4 minutes.
1-4 Etude physiologique
1-4-1 Production de pigments mélanoides
La mise en évidence de la production de ces pigments mélanoides (pigments bruns diffusibles) est réalisée par culture de la souche sur les milieux ISP 6 et ISP 7. Les résultats sont appréciés après 48 heures d’incubation en comparaison avec les milieux témoins non ensemencés, mais incubés dans les mêmes conditions.
1-4-2 Hydrolyse de l'amidon
Ce test est réalisé sur milieu nutritif gélosé contenant 1% d’amidon soluble selon la méthode de Gordon et Smith (1953). Après 14 jours d’incubation à 30°C, la gélose est recouverte d’une solution de lugol. L’hydrolyse est ainsi mise en évidence par l’absence de coloration autour des colonies. A l’inverse, les zones contenant de l’amidon se colorent en brun.
______________________________________________Partie expérimentale
1-4-3 Hydrolyse de la gélatine
Les souches sont ensemencées sur gélose nutritive contenant 0,4% de gélatine, puis incubées 14 jours à 30°C. Les zones où la gélatine n’est pas dégradée s’opacifient lorsqu’une solution de chlorure mercurique à 15% est versée sur la gélose. Les zones claires correspondent aux zones d’hydrolyse de la gélatine. (Williams et Cross, 1971)
1-4-4 Hydrolyse de la caséine
L’hydrolyse de la caséine est étudiée selon la méthode de Williams et Cross (1971), et de Gordon et Smith (1953) sur un milieu gélosé contenant 5% de lait écrémé. L’apparition de toute zone claire autour des colonies après 14 jours d’incubation à 30°C témoigne de l’hydrolyse de la caséine.
1-4-5 Action sur le lait écrémé
Des tubes contenant une solution de lait écrémé en poudre à 10% dans l’eau distillée sont ensemencés et incubés à 30°C. Des observations régulières pendant 14 jours permettent de noter la coagulation ou la peptonisation du lait provoquée par les souches (Williams et Cross, 1971).
1-4-6 Tolérance au chlorure de sodium
Ce test est réalisé sur milieu nutritif contenant 7% (poids/volume) de glycérol. A des tubes contenant 10 ml de ce bouillon, nous ajoutons des concentrations de NaCl (0 ; 3 ; 5 ; 6 ; 7 ; 9 et 10 %). Après ensemencement, les tubes sont incubés à 30°C pendant 14 jours sous agitation. Un trouble du milieu de culture témoigne de la croissance de la souche. La tolérance maximale au NaCl correspond au dernier tube présentant encore une croissance (Tresner et al., 1968).
1-4-7 Croissance à différentes températures des souches représentatives
Les souches actinomycétales isolées de l’eau de sebkha et du sol de sebkha sont ensemencées sur le milieu de culture Sporulation Agar, à raison de 3 boites de Pétri par souche pour chaque température d’incubation. La croissance est estimée pendant 21 jours d’incubation à 5° C, 20° C, 25° C, 27° C, 30° C, 37° C, 45° C et 55° C.
______________________________________________Partie expérimentale
1-5 Etude biochimique
1-5-1 Utilisation de différents substrat carbonés
Cette étude est réalisée sur le milieu ISP 9 Pridham et Gottlieb (1948). Les différentes sources de carbone testées sont les suivantes : xylose, inositol, D-mannitol, D-fructose, D-glucose, L-arabinose, L-rhamnose, saccharose, raffinose, galactose, D-mélibiose, cellulose et pectine.
Des solutions à 10% (Poids/volume) de ces sources de carbone sont stérilisées par filtration sur membrane Millipore (0,45 µ m) à l’exception de la cellulose et l’inositol qui sont stérilisés par immersion pendant une nuit dans l’éther éthylique. Ces derniers sont ensuite évaporés puis remis en suspension dans l’eau distillée (Shirling et
Gottlieb, 1966). Les différents substrats carbonés, stérilisés, sont ajoutés au milieu de
base ISP9 en suspension de façon à obtenir une concentration finale de 1% (Poids/Volume). Après ensemencement et incubation de 3 semaines à 30° C, la croissance est estimée sur les boites contenant les différentes sources de carbone par rapport à celle obtenue sur ISP9 sans source de carbone (témoin négatif) et sur ISP9 contenant 1% de glucose (témoin positif).
1-5-2 Utilisation du citrate comme seule source de carbone
La pente du milieu de citrate de Simmons est ensemencée selon une strie longitudinale au moyen d’une anse de platine avec l’inoculum lavé de la souche. L’incubation s’effectue à 30° C. L’observation de la croissance se fait quotidiennement durant une semaine.
1-5-3 Réduction des nitrates
10 ml de bouillon nutritif contenant 0,1% de nitrate de potassium sont ensemencés et incubés à 30° C. Aux 5ème, 10ème et 14ème jours d’incubation, 3 gouttes de chacun des réactifs de Griess I et II sont ajoutées à 1 ml de culture. (Gordon et Smith,
1953)
La réduction des nitrates en nitrites est mise en évidence par l’apparition d’une coloration rouge. En l’absence de cette coloration, quelques milligrammes de poudre de zinc sont alors ajoutés s’il y a :
o apparition de la coloration rouge : les nitrates du milieu ne sont pas réduits par la souche.
o absence de coloration : les nitrates sont réduits au-delà du stade des nitrites.
______________________________________________Partie expérimentale
1-5-4 Recherche de l’Uréase
4,5 ml d’eau physiologique contenant 4 gouttes du milieu Urée-indole sont ensemencés par 0,5 ml de la souche. La lecture est effectuée après incubation à 30° C pendant 24 heures.
Si la couleur du milieu vire vers le rouge donc Uréase positive Si la couleur du milieu reste jaune donc Uréase négative
1-5-5 Recherche de la production d’indole
4.5 ml d’eau physiologique contenant 4 gouttes du milieu Urée-indole sont ensemencés par 0,5 ml de la souche. La lecture est effectuée après 24 heures d’incubation à 30° C. 2 à 3 gouttes du réactif de Kovacs sont ajoutées à 1 ml de la culture. Une réaction positive se traduit par l’apparition d’un anneau rouge vermillon à la surface.