Como esperado, a maioria das proteínas encontradas no fenótipo BV nas duas linhagens celulares estudadas foram propostas como sendo presentes no nucleocapsídeo e são essenciais para sua formação: VP39, P49, ODV-E27, FP25K, VP80/P87, P24, VP1054, VLF- 1, Desmoplaquina e PEP/PP34 (Tabela 3 e Apêndice A, tabela S2). Dados similares foram relatados nos dois estudos proteômicos com fenótipo BV do grupo NPVs, AcMNPV e HearNPV (Hou et al., 2013; Wang et al., 2010).
A proteína estrutural VP39 é o maior e mais abundante componente do capsídeo, acreditamos ser este o motivo de estar presente em mais de uma banda no gel de poliacrilamida 12% do fenótipo BV nas duas linhagens (Tabela 3 e Apêndice A, tabela S2).
Além de seu papel estrutural, esta proteína ajuda no transporte dos nucleocapsídeos para o núcleo no início da infecção. Posteriormente, os nucleocapsídeos recém formados de BV são encaminhados para a membrana celular, através da reorganização da actina celular que será discutido em maior detalhe na próxima seção (Charlton, Volkman, 1991; Lanier, Volkman, 1998; Ohkawa et al., 2010). Já P49 e a ODV-E27, proteínas conservadas em todos os baculovírus sequenciados até o momento, são consideradas componentes estruturais da base do nucleocapsídeo (Braunagel et al., 2001; Slack, Arif, 2007).
A proteína ODV-E27 (ORF140) possui grande homologia com a ciclina B da lagarta
Bombyx mori e é co-precipitada com a quinase dependente de ciclina celular 2 (cdK2). A
presença do complexo ODV-E27/cdK2 faz com que o ciclo celular seja mantido em fase G2 de divisão celular, até que o baculovírus complete o ciclo de infecção (Baluchamy, Gopinathan, 2005; Braunagel et al., 1998). Também é interessante ressaltar que, durante a análise de expressão temporal, os primeiros transcritos da ORF140 foram detectados a 11 h.p.i na UFL-AG-286, enquanto só foram detectados 48 h.p.i na linhagem IPLB-SF-9 (Oliveira et al., 2013). Este fato corrobora a nossa hipótese de que pode haver um “atraso” na tradução da ODV-E27 na linhagem celular IPLB-SF-9, que desempenha papel importante na modulação de ciclo celular.
Outra proteína associada ao nucleocapsídeo de BV encontrada nas duas linhagens estudadas foi a FP25K. Mutantes desta proteína em AcMNPV apresentam redução do número de corpos de oclusão, mas sem decaimento da formação de nucleocapsídeos e com aumento na produção de BV (Harrison, Summers, 1995). A VP80/P87 e P24 também foram relacionadas aos nucleocapsídeos de BV nas duas linhagens. Esta proteína é essencial para produção de BV e a maturação dos nucleocapsídeos (Tang et al., 2008), como reforçado pela imunomarcação e microscopia confocal em EGFP fusionado a VP80 de AcMNPV (Marek et al., 2011). Além da forte interação com as proteínas p78/83 e VLF-1, bem como sinais de colonização de VP80 com DNA viral recém replicado no estroma virôgenico para formação de novos nucleocapsídeos (Marek et al., 2011). Os homólogos de vp80 são encontrados apenas em Alphabaculovirus (Li et al., 1997; Lu, Carstens, 1992). Ademais, aVP80/P87 interage diretamente com outra proteína essencial para montagem de BV, a 38K, o que sugere que esta proteína deva ser essencial também para o BV do AgMNPV-2D (Wu et al., 2006). Entretanto, os espectros de massas desta proteína só foram encontrados no fenótipo BV na linhagem UFL-AG-286. Em AcMNPV, mutantes de 38K são inviáveis, o que sugere que esta proteína também tenha papel crucial no fenótipo BV do AgMNPV-2D (Hefferon, 2003; Wu
et al., 2006). Por outro lado, P24 é conservada em Alpha e Betabaculovirus, embora sua função seja pouca descrita. A imunoprecipitação em OpMNPV e AcMNPV demonstrou a presença dela nos nucleocapsídeos de BV e ODV (Wolgamot et al., 1993).
Também confirmamos a presença das proteínas VP1054, Desmoplaquina, VLF-1 e PTP/PP34 nos nucleocapsídeos de BV nas duas linhagens de Lepidópteras. Foi interessante encontrar as proteínas VP1054, Desmoplaquina e VLF-1, que estão relacionadas ao empacotamento do DNA viral no nucleocapsídeo. A VP1054 é uma proteína de 43 kDa codificada por um gene core que se associa à VP39 na organização de seus monômeros em anéis para formação do nucleocapsídeo (Olszewski, Miller, 1997b) e é provável que a interação entre VP80/P87, 38K e VP1054 forme a maquinaria que promove a encapsidação do DNA viral (Wu et al., 2008). Em AcMNPV, foi recentemente demonstrado que a ausência de VP1054 reduz drasticamente a produção viral, e que ela é homologa e estruturalmente semelhante à proteína PURα celular (Marek et al., 2013). Estas proteínas foram envolvidas com múltiplos papeis celulares, como se ligar a DNA fita simples e RNA, preferencialmente em sequências repetitivas compostas de GGN, onde “N” pode ser qualquer nucleotídeo (Marek et al., 2013). Provavelmente, durante sua evolução os baculovírus “sequestraram”
vp1054 (PURα) de um hospedeiro ancestral e ela se tornou essencial para a produção da
progênie viral (Marek et al., 2013). Como já mencionado, VLF-1 é conservada e possui papel importante na ativação da expressão dos genes muitos tardios em ODV. Portanto, esperamos que o fato desta proteína estar presente no fenótipo BV está mais relacionado a sua atividade de ligação ao DNA pós replicação, exercendo seu papel de recombinase em sítios específicos e processando o DNA viral para o empacotamento dos novos nucleocapsídeos (Vanarsdall et al., 2006).
Com os dados obtidos no fenótipo BV nas duas linhagens, encontramos a proteína conservada envolvida com o enovelamento do DNA viral, a Desmoplaquina. Devido a sua homologia com proteínas envolvidas com ciclo celular, como topoisomerases I, miosina e proteína centromérica (Rohrmann, 2011), é provável que esta proteína também esteja envolvida no empacotamento do DNA viral no AgMNPV-2D. Como já discutido, a proteína PEP/PP34 de 32 kDa, exerce um papel importante na estrutura e proteção do fenótipo ODV no meio ambiente (Apêndice A, seção discussão) (Braconi et al.). No entanto, encontramos esta fosfoproteína também no BV, corroborado pelos dados obtidos no BV do AcMNPV e do HearNPV (Hou et al., 2013; Wang et al., 2010).
Além das proteínas anteriormente descritas, também identificamos a PP31 e a ME53 em mais de um espectro de massas no BV isolado em UFL-AG-286 e em apenas um espectro no BV de IPLB-SF-9. A PP31 é uma fosfoproteína de 30 kDa exclusiva do fenótipo BV envolvida na regulação da expressão de genes tardios (Guarino et al., 2002; Schultz, Friesen, 2009; Yamagishi et al., 2007), que não é essencial para a infectividade deste fenótipo (Wang et al., 2010; Yamagishi et al., 2007). Já a proteína ME53 é conservada em Alpha e
Betabaculovirus e experimentos knockout sugeriram inicialmente que estivesse envolvida na
replicação de DNA (Xi et al., 2007). Mais recentemente, em AcMNPV, a ME53 foi envolvida na produção de BV, sem afetar a replicação do DNA viral (de Jong et al., 2009).
Com os espectros de massas obtidos, também observamos proteínas de envelope compartilhadas no fenótipo BV entre as duas linhagens, e não foi surpresa encontrar a glicoproteína GP64 (Tabela 3 e Apêndice A, tabela S2). Curiosamente, também encontramos a proteína F, que é utilizada pelos nucleopoliedrovírus do grupo II e pelos granulovírus e possui função similar a GP64. Os únicos baculovírus que não possuem homólogos da proteína F são NeleNPV (Lauzon et al., 2004) e NeseNPV (Garcia-Maruniak et al., 2004). No grupo NPV I, a proteína F aparentemente perdeu sua função original mas ainda foi relacionadas ao aumento da infectividade oral no fenótipo ODV (Lung et al., 2003).
A proteína ODV-E18 de 9kDa, também foi encontrada no BV derivado da linhagem IPLB-SF-9, sendo essencial para produção de BV (McCarthy et al., 2008). Estudos de imunoprecipitação e expressão gênica em nucleopoliedrovírus demonstraram que as ORFs que codificam para ODV-E18 e a ODV-E27, são transcritas como um RNA mensageiro bicistrônico (Braunagel et al., 1996b; Katsuma et al., 2011). Interessantemente, no genoma do AgMNPV-2D, a ORF 139 (ODV-E18) e a ORF 140 (ODV-E27) estão localizadas na fita positiva a 15 pares de base de distância. Quando traduzidas, estas duas proteínas formam um heterodímero chamado de ODV-E35, que acredita-se ser capaz de estabilizar a ligação da base do nucleocapsídeo com o envelope viral (Braunagel et al., 1996b).
Outra proteína compartilhada é a ODV-E25, que apresenta um sinal transmembrânico N-terminal e foi encontrada no fenótipo BV nas duas linhagens, mas é muito mais abundante no fenótipo ODV. Assim como a ODV-E25, a ODV-E56 apresenta um forte sinal transmembrânico (mas C-terminal) necessário para translocação desta proteína do núcleo para o envelope. Ela está presente no fenótipo BV e não é essencial para formação da partícula viral como no fenótipo ODV (Braunagel et al., 1996a).
Como mencionado em resultados, a proteína V-Ubiquitina de baixo peso molecular (9 kDa) também foi identificada no BV nas duas linhagens estudadas. Proteínas Ubiquitinas estão amplamente distribuídas nos eucariotos, procariotos e nos vírus. Elas se ligam covalentemente à proteínas celulares e mudam a estabilidade, localização e atividade das mesmas. Sua atividade resulta na degradação da proteína alvo (Welchman et al., 2005). No fenótipo BV, a V-ubiquitina se encontra covalentemente ligada à parte interna da membrana, mas não é essencial para sua replicação (Guarino, 1990; Reilly, Guarino, 1996).
5.2.2 Diferenças encontradas no fenótipo BV nas duas linhagens celulares estudadas são