I. Appareillages
I.1. Radioprotection
Au cours de notre projet, nous avons été amenés à manipuler des matières radioactives, donc certaines règles de sécurité et de contrôle doivent respectées.
I.1.1 Principe et règles de radioprotection
La radioprotection désigne l'ensemble des mesures et des moyens destinés à assurer la protection du personnel et de son environnement contre les effets néfastes des rayonnements ionisants tout en permettant leurs utilisations.
Les rayonnements à parcours limité (α, β) perdent toute leur énergie en traversant la matière et peuvent donc être éventuellement arrêtés. En revanche, les rayonnements à parcours non limité (rayons X, γ) ne subissent qu'une atténuation progressive. Compte tenu de leurs énergies, les rayonnements ionisants ont des effets néfastes sur les organes, les cellules et particulièrement sur l'ADN qui peuvent être :
Stochastiques (aléatoires) : Pour des faibles doses absorbées et dans le cas ou la cellule a réussi à se réparer mais de manière incomplète, entrainant ainsi des modifications de sa fonction.
Déterministes : Pour des doses plus fortes, entraînant la mort de la cellule à plus ou moins court terme.
Sabrine Gharbi & Sabrine Khammassi 34 Chaque tissu ou organe, n'a pas la même radiosensibilité. Dans ce cas, on est amené à utiliser la notion de dose efficace, particulièrement lorsque l'irradiation du corps n'est pas homogène, ou si partielle. La dose efficace s'exprime également en Sievert (Sv).
Le but essentiel de la radioprotection est de réduire au-dessous des normes admissibles la dose, individuelle ou collective, reçue. A cet égard, il existe trois règles de protection :
1. Limiter la durée de l'exposition : Le travail doit s'effectuer rapidement, avec efficacité et selon un plan logique.
2. Augmenter la distance : L'intensité du rayonnement décroît rapidement lorsqu'on s'éloigne de la source. Elle est inversement proportionnelle au carré de la distance.
3. Employer des écrans : Les écrans doivent être constitués de matériaux spécialement choisis pour absorber les différents rayonnements. Par exemples, le rayonnement γ est atténué efficacement par des matériaux de densité élevée (bétons spéciaux, fer, plomb).
I.1.2.Moyens de radioprotection a. Cellule blindée
C’est une sorte de boîte à gants construite par un alliage de fer et de plomb. La cellule est dotée d'un écran de verre traité par du plomb et de quatre fenêtres permettant la manipulation à l'intérieur de la cellule. Le marquage au 99m Tc s’effectue sous cette hotte plombée en dépression avec aspiration d’air dans un filtre de charbon actif. Ceci empêchera toute fuite de radioactivité.
Sabrine Gharbi & Sabrine Khammassi 35
Figure 7: Cellule blindée
b. Dosimètre
C’est un instrument de mesure destiné à évaluer la dose radioactive ou l'équivalent de dose reçus par une personne exposée à un rayonnement ionisant. Le port de cet accessoire est obligatoire pour tout le personnel du laboratoire.
Figure 8: Dosimètre
c. Briques en plomb
Parfois on est amené à manipuler en dehors de la cellule blindée pour effectuer une analyse Chromatographie sur Couche Mince (CCM) ou une radiochromatographie. Pour cette raison, on doit placer un écran constitué par des briques en plomb pour minimiser le taux d’irradiation.
Sabrine Gharbi & Sabrine Khammassi 36 I.1.3. Instruments pour la mesure de la radioactivité
a. Activimètre
C’est un appareil permettant la mesure de l'activité des radioisotopes ou produits radiomarqués (radiopharmaceutiques). Cet instrument sert à mesurer des grandes valeurs de radioactivité (de l'ordre de MBq). L'activimètre est de type CAPINTEC, INC. CRC_ 35R.
Figure9: Modèle d’un activimètre
b. Radiochromatographe
Cet instrument est utilisé pour s’assurer de la qualité du radiomarquage. Le système est formé d'un moteur pas à pas qui assure la translation linéaire du détecteur par rapport à une plaque graduée sur laquelle le support chromatographique est fixé.
Les rayonnements émis sont détectés par une sonde et seront convertis, par un logiciel, en une courbe montrant la répartition de la radioactivité sur le support chromatographique. Cet appareil permet aussi de quantifier la pureté radiochimique et le rendement du marquage. Le radiochromatographe utilisé est de type mini-GITA de Ray Test (Fig. 10).
Figure10: Modèle de Radiochromatographe
Sabrine Gharbi & Sabrine Khammassi 37 I.2. Techniques analytiques et spectroscopiques
I.2.1-Chromatographie sur Couche Mince (CCM)
C’est une méthode simple permettant un contrôle aisé et rapide de la pureté d'un composé organique. Cette technique repose principalement sur des phénomènes d'adsorption.
La phase mobile est un solvant ou un mélange de solvants et la phase stationnaire est un adsorbant (gel de silice, alumine, cellulose) fixé sur une plaque de verre ou sur une feuille semi-rigide de matière plastique ou d'aluminium. L'échantillon liquide ou solubilisé dans un solvant volatil est déposé ponctuellement sur la plaque et en contact de la phase mobile, l'éluant monte progressivement par capillarité à travers la phase stationnaire entraînant avec lui les différents composants de l’échantillon qui migrent à leurs propres vitesses derrière le front du solvant. Cette vitesse dépend d'une part, des forces électrostatiques retenant le composant sur la phase stationnaire et, d'autre part, de sa solubilité dans la phase mobile.
Généralement, en CCM, les substances de faible polarité migrent plus rapidement que les composants polaires.
Le paramètre utilisé pour l’analyse qualitative est le facteur de rétention (rapport frontal) noté Rf qui relie la distance parcourue par le composé (di) et la distance parcourue par le front du solvant (Fig.11)
La valeur de Rf est comprise entre 0 et 1. Pour obtenir des valeurs Rf reproductibles, il est nécessaire d’opérer dans des conditions opératoires identiques.
Sabrine Gharbi & Sabrine Khammassi 38
Figure11: Principe de la CCM
I.2.2 Chromatographie préparative
Cette technique est utilisée pour purifier des produits qui sont destinés à d'autres utilisations. Son principe est le même que celui de la CCM.
Le gel de silice est emploié comme phase stationnaire .Il est maintenu sur une plaque de verre (support). L’échantillon à purifier est déposé, à plusieurs reprises, tout au long de la ligne de base afin de le concentrer. Une fois l’éluant adéquat (phase mobile) est choisi, la plaque est place dans une cuve pour réaliser la séparation. A la fin de la migration, la zone contenant le composé recherché est localisé, sous UV,.
Cette bande est grattée et le tas de silice obtenu, contenant le composé, pourra être traité par filtration sur une micro-colonne.
I.2.3.Chromatographie Liquide Haute Performance (CLHP)
C’est une technique de séparation, d’analyse et de dosage d'un composé ou un mélange de composés. Elle est fréquemment utilisée pour s’assurer de la pureté des produits.
A l'instant initial, l'échantillon à analyser est injecté à l'entrée de la colonne où il se dilue dans la phase mobile puis il est entraîné à travers la colonne (phase stationnaire). Cette colonne peut contenir des granulés poreux (colonne remplie) ou être recouverte à l'intérieur d'un film mince (colonne capillaire). Souvent, la composition de la phase mobile est modifiée au cours de l'analyse, c'est le mode dit
Sabrine Gharbi & Sabrine Khammassi 39 gradient qui est en opposition au mode isocratique, pour lequel la composition de la phase mobile reste constante tout au long de l’analyse.
Généralement, les solvants utilisés sont des combinaisons miscibles d'eau et de divers liquides organiques (alcools, acétonitrile, dichlorométhane, etc.).
Figure 12: Principe de fonctionnement de la CLHP
Lors de la traversée de la colonne, les solutés sont inégalement retenus. Ce phénomène appelé rétention est en fonction de l’hydrophobicité et de la polarité des molécules. Un détecteur placé à la sortie de la colonne couplé à un enregistreur permet d'obtenir un tracé appelé chromatogramme. Ce tracé apparaît sous forme d’un signal constant appelé ligne de base en présence du fluide porteur seul (phase mobile). Lors du passage d’un soluté séparé, le signal détecté apparaît sous forme d'un pic.
Au cours de notre projet, nous avons utilisé un appareil de type CLHP SHIMADZU® constitué de (Fig.13).
Figure 13: CLHP SHIMADZU®
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II. Méthodes radiochimiques
II.1.Synthèse du dérivé du sulfanilamide (N-Sulfanilamide- ferrocène-carboxamide)
II.1.1.Réaction
Le chlorure ferrocénique (372 mg ; 1,5 mmol ; 1 éq) et le sulfanilamide (258 mg ; 1,5 mmol ; 1 éq) sont versés dans un ballon monocol rodé de 100 ml préalablement séché et placé dans un bain d’huile. Afin d’éviter la présence de toute trace d’air dans le milieu réactionnel, la pyridine anhydre (10 ml) est ajoutée à l’aide d’une seringue. La réaction est mise sous agitation, sous azote et sous reflux en présence d’un réfrigérant pendant 2 h. Après une heure, le suivi de la réaction est assuré par CCM. Sur une même plaque, on dépose une goutte de chaque réactif de départ (chlorure ferrocénique et sulfanilamide) dilué dans quelques millilitres d’EtOH.
La fin de la réaction est détectée après 2 h suite à la disparition de la tache relative au sulfanilamide au niveau du mélange réactionnel. Ce temps correspond à un rendement maximal de la réaction puisque le sulfanilamide a totalement réagit.
Le produit obtenu sera versé dans un autre ballon de 200 ml et on ajoute du CH2Cl2 pour dissoudre le maximum de produit puis de l’hexane froid pour provoquer une précipitation du produit dessiné, on observe ainsi une précipitation d’un produit beige qui apparaît en agitant doucement.
Le mélange est par la suite filtré par aspiration sur un verre fritté afin d’éliminer la phase liquide et récupérer la phase solide, On obtient ainsi une poudre beige.
Etant donné qu’il y’a eu apparition de deux bandes d’intensité différentes ce qui montre la présence d’une impureté, on se propose alors à effectuer une séparation par chromatographie sur colonne afin de purifier le produit. Le dérivé du sulfanilamide est ainsi obtenu sous forme d’une poudre de couleur orangée.
Sabrine Gharbi & Sabrine Khammassi 41 II.1.2.Analyse de la pureté
Le SFC, obtenu est analysé par CLHP afin de s’assurer de sa pureté. Une faible quantité du produit est dissoute dans quelques millilitres d’EtOH, puis injectée à l’entrée de la colonne.
Le système chromatographique opère avec un débit d’élution de 1 ml.min-1. La phase mobile est un mélange d’eau ultra-pure (0,1% TFA) et de MeOH, V/V.
L’élution se fait selon un mode isocratique. La détection est réalisée à 254 nm à l’aide d’un détecteur UV-visible.
II.2. Marquage au technétium 99m
• Le radiomarquage de notre dérivé de sulfanilamide a été effectué selon deux méthodes différentes [24].
Cette opération est réalisée dans la cellule blindée, les étapes suivantes ont été réalisées:
• Optimisation et réaction finale du marquage
Le SFC (1 mg) et le Mn(CO) 5Br (1 mg) sont pesés dans un flacon.150 µl du solvant et 150 µl d’une solution physiologique de pertechnétate sodique sont par la suite ajoutés. Afin d’éliminer toute trace d’oxygène, le mélange réactionnel est barboté et scellé sous azote, puis marqué avec le technétium par différentes méthodes afin d’obtenir le meilleur rendement.
• Analyse radio chromatographique
Pour vérifier que la molécule est marquée au Tc99m, une analyse par radiochromatographie a été réalisée. Sur une première plaque CCM, on dépose une goutte de technétium libre (99mTcO4-). Cette dernière va nous servir de témoin. A l’aide d’une microseringue, on prélève quelques gouttes du milieu réactionnel qu’on dépose ponctuellement sur une deuxième plaque CCM. La phase mobile utilisée est un mélange de EtOH absolu (9.5:0.5).
Sabrine Gharbi & Sabrine Khammassi 42
• Purification et analyse par CLHP
La séparation de la molécule radiomarquée est réalisée par une chromatographie préparative. A la base d’une plaque CCM (support en verre 20 cm/ 20 cm), le mélange réactionnel à purifier est déposé, à l’aide d’une micropipette,. La phase mobile est la même utilisée dans l’analyse radiochromatographique. Après migration, la plaque est révélée par le radiochromatographe afin de localiser la bande correspondante à notre produit marqué. Une fois grattée, le tas de silice obtenu est lavé par l’éluant sur une micro-colonne. Le filtrat élué est séché sous azote afin d’évaporer le solvant. Avant l’injection, quelques millilitres d’EtOH sont ajoutés pour dissoudre le produit.
L’analyse a été réalisée dans les mêmes conditions opératoires sauf que la détection est assurée par un détecteur γ.
II.3 Etude in vitro
Afin de prouver la fixation de la molécule marquée sur la bactérie cible (E.coli), nous avons utilisé des filtres de 0.22µm et 3 tubes eppendorf contenant:
• Tube 1: E. coli + SFC.
• Tube 2: E. coli soniqué + SFC.
• Tube 3: LB seul + SFC
La filtration est réalisée suite à l’incubation des tubes à 37°C pendant 1 h. le pourcentage de la fixation du SFC sur l’E.coli est mesuré,ensuite dans un compteur à puits, en nombre de coups par minute (cpm).
III. Etude bactériologique
III.1. Préparation du milieu de culture
Un milieu de culture est préparé dans un erlène à raison de 1 % tryptone, 0,5 % d’extrait de levure, 1 % NaCl, et 1,5 % de bacto-agar. la stérilisation est réalisée dans une autoclave à 120°C pendant 20 min. Les boîtes sont coulés dans d’un environnement stérile .une fois le milieu refroidi à une température de 45-50°C. Pour
Sabrine Gharbi & Sabrine Khammassi 43 cette effet le plan de travail est nettoyé par un désinfectant (Eau de javel ou alcool à 90°C) puis au centre du plan un bec Bunsen est allumé et régler à la flamme bleue.
L’environnement est estimé stérile dans un rayon de 30 cm autour de la flamme.
Une fois cette opération terminé, les boîtes coulées sont couvertes et laissés sécher, sans les retourner, pendant 24h à température ambiante.
III.2. Cultures bactériennes sur milieu solide
Avant et après chaque usage l’anse est stérilisé par le passage de son extrémité en platine dans la flamme.
a. Repiquage et étalement sur milieu solide
L’inoculum prélevé par l’anse est déposée sur la boîte de pétri en décrivant u mouvement en dents de scie avec l’anse, depuis le fond jusqu'en haut de l’agar (Fig.
14)
Figure 14: Repiquage d’une boîte etalement stries
Après un temps de développement à l’étuve à 37°C pendant 24h on remarque que La striation en quadrant permet d’avoir des colonies bien séparées. (Fig. 16)
Figure 15: colonies isolées
Sabrine Gharbi & Sabrine Khammassi 44 On peut repiquer ensuite chaque clone sur des milieux stériles. On a ainsi des souches bactériennes pures que l’on peut déterminer et étudier.
Figure 16: E coli X1blue
b. Culture en milieu liquide et pipetage stérile
Cette manipulation se fait à l’aide d’un micropipette dans des conditions stériles.
- Dans un erléne contenant 20 ml de milieu riche 2 ml d’une préculture d’E. coli préparer la veille, sont ajoutés de telle façon à avoir au temps t0 une densité optique voisine de 0,15 mesuré avec un spectrophotomètre à une longueur d’onde de 600 nm.
On met l’erléne à incuber dans le shaker à 37°C.
Figure17: Milieux liquides
Sabrine Gharbi & Sabrine Khammassi 45 III.3.Testes bactériologiques
III.3.1.Vérification de l’effet bactériostatique
Une préculture d’E. Coli est préparé par l’incubation à 37°C sous agitateur pendant la nuit (culture over night).
Trois erlène sont préparés de sorte que le premier contient la culture E. coli seule, le deuxième contient la sulfanilamide avec une concentration de 2 g/l d’E. coli et le troisième contient SFC et E. coli (Fig.18).
Figure18: Préparation de culture
Les cultures ainsi préparées sont incubées sous agitation dans le shaker à37°C(Fig.19), et à des intervals de temps régulier (chaque 60 min ) un échantillons de 1ml de culture est prélevé, dilués 1ml de milieu LB puis la DO 600 nm est mesurée.
Figure 19: Culture dans le shaker
Sabrine Gharbi & Sabrine Khammassi 46 III.3 2.Etude de stabilité
A fin de pouvoir utiliser cette nouvelle molécule in vitro nous allons procéder à l’étude de sa stabilité dans des conditions proches des conditions physiologiques.
On utiliser un sérum de mammifères dans un eppendorf de 1,5 ml nous avons mélangé 0.5 ml de sérum frais, avec 0.5 ml d’ SFC marqué .le mélange est incubée à 37°C .les aliquotes sont prélevés à 30 min ,1h, 20h et sont analyser par chromatographie instantanée sur couche mince (ITLC) et on utilisant l’acétone comme phase mobile .Avec l’acétone le technétium migre au front et la molécule marquée reste à la base.
Après migration, les bandelettes sont coupées sur deux, puis chaque moitié est mesurée par le compteur à puits
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I. Synthèse du dérivé du sulfanilamide
La réaction se déroule en faisant réagir le chlorure ferrocénique et le sulfanilamide, en présence du pyridine anhydre pour donner le N-sulfanilamide-férrocéne carboxamide.
Figure20: Synthèse d’un dérivé du sulfanilamide: N-Sulfanilamide-ferrocène-carboxamide.
La qualité de la réaction a été évaluée en premier par CCM dont la phase mobile est constituée de CH2Cl2 et EtOH absolu avec un pourcentage de (9.5:0.5). Le Rf étant égale à 0,5.
La caractérisation de la molécule est réalisée par RMN H1 et par HPLC. Ce ci a révélé un temps de rétention de 5,8 min.
Le chromatogramme qui suit confirme la pureté de la molécule.
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Figure 21:Profile HPLC du SFC
II. Marquage du N-sulfanilamide-férrocéne carboxamide
Le produit radiomarqué est obtenu suite à un échange atomique entre le fer et le technétium sachant que le mécanisme du marquage n’a pas été entièrement établi dans la littérature [25].
La qualité et le rendement des réactions de marquage radioactif ont été évalués par radiochromatographie sur des plaques de gel de silice (CCM) sur lesquelles ont été fait migrer le produit de réaction avec un éluant constitué de dichlorométane et d’éthanol dans les proportions respectives (9.5: 0.5).
En premier temps, le DMF a été utilisé comme solvant pour la réaction de marquage en suivant le protocole de Wenzel [26] .Le rendement, du marquage était de 30 %.( fig.22).
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Figure 22:CCM sur gel de silice en dichlorométhane – éthanol (9.5: 0.5)
Pour optimiser notre travail nous avons opté à changer le DMF par le DMSO.
Qui nous a conduits à une amélioration du taux de marquage de 30 à 50%.
Figure 23 : CCM sur gel de silice en dichlorométhane – éthanol (9.5: 0.5)
Malgré les bons résultats obtenus suite au changement du solvant de la réaction, nous avons procédé à l’utilisation d’une autre méthode, développée par M Trabelsi [27], qui s’agit d’effectuer le marquage au micro-onde en gardant les autres paramètres décrits précédemment.
Ce ci nous a permis d’avoir un meilleur rendement de marquage égale à 87% (Fig.24).
ray test Isotopenmeßgeräte GmbH file: S IH E M200 method: 99MTC-P R date: 17/07/2007 time: 15:50:23
count ti me: 60 s smoothing constant: 2.0 mm HV : 800 V LL: 70 keV UL: 200 k eV ori gin: 0.0 mm s olvent front: 99.9 mm
mm
0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 80.0 90.0 100.0 110.0 120.0
Cnts
0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 80.0 90.0 100.0 110.0 120.0
Cnts
0.0 100.0 200.0
Sabrine Gharbi & Sabrine Khammassi 50
Figure 24: CCM sur gel de silice en dichlorométhane – éthanol (9.5: 0.5)
Le radiochromatogramme montre deux pics radioactifs de Rf différents : Celui de Rf nul correspond au pertechnétate non réduit. Ceci est démontré dans le radiochromatogramme qui suit et qui correspond à la (CCM) du pertechnétate seul(Fig.25).
Figure 25: CCM sur gel de silice en dichlorométhane – éthanol (9.5: 0.5)
Le deuxième pic de Rf =0,54, proche de celui de la molécule non marquée (bande jaune), révèle une activité très élevée. La quantification de l’aire de ce pic montre un rendement de radiomarquage de l’ordre de 87%
Les rendements de radiomarquage les plus élevés sont obtenus lors du marquage au Micro-onde par rapport à ceux dans le bain d’huile.
ray test Isotopenmeßgeräte GmbH file: S FC53 method: 99MTC-P R date: 27/01/2009 time: 13:34:16
count ti me: 60 s smoothing constant: 1.0 mm HV : 800 V LL: 70 keV UL: 200 k eV ori gin: 0.0 mm s olvent front: 99.9 mm
mm
0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 80.0 90.0 100.0 110.0 120.0
Cnts
0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 80.0 90.0 100.0 110.0 120.0
Cnts
0.0 100.0 200.0
TC99M
Sabrine Gharbi & Sabrine Khammassi
rendement de marquage par rapport à la méthode traditionnelle, du f
d’atteindre la température favorable pour déstabiliser le noyau ferrocènique et attacher le technétium, dans un temps optimum.
III. Etude de la stabilité
Ce test permet de connaitre la durée de la stabilité de l’antibiotique dans des conditions proche des conditions
temps au bout de quelle produit radiomarqué reste intact et pourrait servir à une injection in vivo.
Le diagramme ci-dessous montre que notre produit reste stable durant presque 20h. rendement de marquage par rapport à la méthode traditionnelle, du f
la température favorable pour déstabiliser le noyau ferrocènique et attacher le technétium, dans un temps optimum.
de la stabilité
permet de connaitre la durée de la stabilité de l’antibiotique dans des conditions proche des conditions physiologiques, à fin de pouvoir
temps au bout de quelle produit radiomarqué reste intact et pourrait servir à une
dessous montre que notre produit reste stable durant presque
dessous montre que notre produit reste stable durant presque