Rôle de la TPO sur la voie NHEJ

L’action de la TPO sur la réparation de l’ADN a été observée uniquement sur des cassures double brins. En effet, la mesure des cassures simple brin par des expériences de comètes en condition basique à temps précoce après irradiation, ne montre pas d’effet de la TPO sur leur réparation. Deux voies majeures sont utilisées pour réparer les cassures double brins : la voie de la recombinaison homologue et la

voie de la NHEJ. Nous avons testé l’action de la TPO sur la voie de la recombinaison homologue en analysant par immunofluorescence la cinétique de formation de foci Rad51 et celle-ci n’est pas modifiée en présence de TPO. De plus, la TPO ne permet pas la réparation de cassures double brins induites par des inhibiteurs de la réplication comme l’hydroxyurée ou la campthotécine qui sont généralement réparées par la voie de la recombinaison homologue puisque ces drogues bloquent les cellules en phase S. La TPO a un effet sur la réparation de l’ADN de différents types de cellules, les LSK-CD34-, les LSK, les Lin- et les UT7-Mpl bien que les proportions en G0/G1/S soient différentes. Seule la voie NHEJ peut être utilisée dans toutes les phases du cycle. Ces résultats suggèrent que la TPO n’a pas d’effet sur la voie de la recombinaison homologue.

Nous avons montré que la TPO améliore la réparation de l’ADN des CSH lors de stress génotoxiques en agissant directement sur la voie NHEJ. L’inhibition de la DNA-PK empêche totalement la résolution des foci γH2AX observée en présence de TPO. De plus l’injection de TPO dans des souris SCID déficientes pour DNA-PK, n’a pas d’effet bénéfique sur la réparation de l’ADN des CSH. Lors d’une cassure double brins, la DNA-PK se fixe au niveau des extrémités d’ADN libres et forme des foci visibles par microscopie, elle est ensuite activée par autophosphorylation sur les sites serine 2056 et thréonine 2609. Ces sites sont donc des marqueurs de l’activité de DNA-PK. La mutation de ces deux sites en alanine induit une diminution de la voie NHEJ (Chan et al., 2002). Nous avons mesuré l’activation de DNA-PK par immunofluorescence dans les cellules humaines CD34+CD38- et dans la lignée UT7- Mpl, en comptant le nombre de foci phospho-Ser2056 ou phospho-Thr2609 par cellule. Cette technique nous a permis de montrer que le nombre de foci phospho- DNA-PK est augmenté en présence de TPO. Ces résultats sont confirmés par l’utilisation de substrats (présentés dans la Figure 5A et 5B de l’Article 1) sous forme plasmidique dans les progéniteurs hématopoïétiques murins ou intégrés dans le génome dans les cellules UT7-Mpl et qui mesurent spécifiquement l’activité NHEJ.

La voie NHEJ est considérée comme mutagène. En effet, les radiations ionisantes induisent des dommages sur les bases et sur les sucres et une lyse des extrémités

brins. Ainsi, la présence de mutations autour du site de cassure est une caractéristique de la réparation par la voie NHEJ. C’est un mécanisme rapide qui permet la liaison directe des brins d’ADN. En effet, la plupart des cassures de l’ADN sont réparées par la NHEJ dans les 2h qui suivent le traitement (Goodarzi et al., 2010). Les extrémités des brins libres restent proches dans l’espace et dans le temps. Plus la réparation est lente, plus il est probable que ces extrémités interagissent ensemble et que des translocations se forment. Ainsi, une modification de la cinétique de réparation peut améliorer le niveau de réparation ou au contraire induire une instabilité génomique. La DNA-PK forme rapidement un pont entre les extrémités libres de l’ADN ce qui évite l’échange de brin et elle bloque également l’accès aux protéines de résection qui conduisent à la réparation par microhomologies et par Alt-NHEJ.

Nos résultats de comètes montrent qu’en absence de DNA-PK, il n’y a pas de réparation augmentée en présence de TPO, ce qui suggère que la TPO utilise une voie dépendante de DNA-PK pour réparer les cassures de l’ADN. En absence de TPO, l’analyse des événements de réparation montre une cinétique beaucoup plus lente et indépendante de DNA-PK car l’inhibition de la DNA-PK n’empêche pas cette réparation (Article 1, Figure 4C). La voie Alt-NHEJ est indépendante de la DNA-PK et nécessite la présence de microhomologies dans la région du site de cassure. Pour vérifier l’utilisation de la voie Alt-NHEJ en absence de TPO, nous avons utilisé le plasmide substrat présenté dans la Figure 5A de l’Article1, transfecté dans des cellules UT7-Mpl. D’une part nous montrons que la TPO augmente la capacité de liaison par NHEJ dans ce système. D’autre part en séquençant les extrémités des cassures, nous avons observé qu’en présence de TPO, le nombre de séquences parfaitement réparées est plus élevé. Nous pouvons également observer une apparition de grandes délétions (supérieures à 100 paires de base) en absence de TPO. La présence de microhomologies est observée sur 15% et 44% des séquences en présence ou en absence de TPO, respectivement (Annexe 2 Figure 1). Ces résultats suggèrent que la Alt-NHEJ est augmentée en absence de TPO.

Mohrin et al. montrent que les CSH du fait de leur quiescence, n’utilisent que la voie NHEJ et que cette voie induit une instabilité génomique dans ces cellules (Mohrin et al., 2010). Nous confirmons l’utilisation de la NHEJ dans les CSH et qu’il existe une instabilité génomique transmissible à la descendance après irradiation des CSH sauvages. Dans notre étude nous montrons que la TPO améliore la réparation de l’ADN des CSH en augmentant l’efficacité et la fidélité de la voie NHEJ. La TPO augmente la cinétique de réparation de l’ADN et active plus fortement la DNA-PK ce qui favorise d’une part la NHEJ et d’autre part empêche l’utilisation de la voie Alt- NHEJ qui est fortement mutagène. Il serait intéressant de regarder l’effet de la TPO sur les protéines de la voie Alt-NHEJ et notamment sur PARP1 qui est l’initiateur de cette voie (Audebert et al., 2004). Une étude récente a montré que l’inhibition de PARP1 dans une lignée de fibroblastes humains diminue le nombre de translocations chromosomiques induites par l’irradiation ou l’étoposide (Wray et al., 2013).

Figure 39 : Schéma de l'impact de la TPO sur la réparation de l'ADN des CSH

Nos résultats suggèrent que le rôle de la TPO est de guider la réparation vers la NHEJ classique qui est dépendante de DNA-PK en augmentant l’activation de cette

première démonstration qu’un facteur de la niche impliqué dans la maintenance des CSH peut également réguler la réponse de ces cellules aux dommages de l’ADN en contrôlant directement les mécanismes de réparation. Il serait intéressant de regarder si la production de TPO par les ostéoblastes dans la moelle osseuse augmente après irradiation.