Rôle de Sfi1 dans la duplication et séparation des SPBs

Chez la levure Schizosaccharomyces pombe, un organisme modèle pour l’étude de la division cellulaire, les homologues des centrosomes sont les SPBs (pour Spindle Pole Body). Bien qu’ils possèdent une structure en plaques attachées à l’enveloppe nucléaire très différente des centrosomes, ils sont essentiels à l’établissement d’un fuseau mitotique intra-nucléaire. Ainsi, les défauts de duplication du SPB aboutissent systématiquement à la formation de fuseaux monopolaires incapables de ségréger les chromosomes. De plus, Les SPBs sont liés à une structure annexe spécifique appelée demi-pont, quand ils ne sont pas dupliqués, puis pont, quand elle relie les deux SPBs dupliqués. Les deux principaux composants du pont sont Cdc31 et Sfi1 (Kilmartin, 2003;

Figure 2: composition et architecture des centrioles

Les centrioles sont formés par neuf triplets de microtubules ce qui leur confère une symétrie en neuf. Les deux centrioles possèdent différentes caractéristiques. Le centriole père possède des appendices distaux. De plus, la region la plus distale du centriole père est composée de neuf paires de microtubules au lieu de triplets.

Le centriole fils, dupliqué à partir du centriole pére est caractérisé par la présence d’une structure appelée « la roue » ou « cartwheel » en anglais. Cette structure se trouve sur le bout proximal du centriole et est perdue lors des étapes de maturation dans les centrioles chez les cellules mammifères.

Les composants moléculaires des deux centrioles varient aussi selon leur position : certains composants comme la centrine ou CP110 sont distaux alors que d’autres comme CPAP ou CEP135 sont proximaux.

Li et al., 2006; Paoletti et al., 2003). Sfi1 est une protéine linéaire formée de répétitions d’hélice α (20 répétitions chez S.pombe et 17 dans la protéine humaine) formant des sites de liaison pour la protéine globulaire Cdc31. Sfi1 s’assemble en réseau de molécules parallèles interagissant avec le SPB via leur domaine N-terminal. Au cours de la duplication, un second réseau antiparallèle s’assemble, connecté au premier via le domaine C-terminal de Sfi1 (Anderson et al., 2007; Li et al., 2006 ; Fig. 3). Ceci crée un site d’assemblage pour un nouvel SPB. Cependant, on ignore complètement quand le second réseau de Sfi1 s’assemble, comment son assemblage est régulé afin de limiter le nombre de cycles de duplication à un par cycle cellulaire et enfin comment le pont se rompt à l’entrée en mitose pour permettre l’assemblage du fuseau mitotique.

Figure 3 - Composition et duplication du demi-pont chez la levure S.cerevisiae

Au cours de ma thèse, je me suis intéressée dans un premier temps au rôle du demi-pont dans la duplication et la séparation des SPBs conduisant à l’établissement d’un fuseau bipolaire chez la levure S.pombe. Cette étude a permis d’établir la fonction de Sfi1 chez la levure et les résultats ont été publiés dans la revue « Journal of Cell Science ». Dans un premier temps, nous avons confirmé que Sfi1 est aussi un composant du demi-pont chez la levure S.pombe. Pour cela, nous avons colocalisé Sfi1 avec des composants du SPB et avec Cdc31. Nous avons observé que la localisation de Sfi1 avec les composants de demi-pont n’était pas parfaite, et que lorsqu’on pouvait définir deux SPBs dupliqués, le signal de Sfi1 était localisé entre les deux. En revanche la colocalisation avec Cdc31 était parfaite, et ce, tout au long du cycle cellulaire. Cette observation permet de conclure que Sfi1 est bien un composant du demi-pont (Bouhlel et al., 2015).

Chez la levure S.cerevisiae, le demi-pont est composé d’un réseau parallèle de molécules de Sfi1 et Cdc31. La duplication du SPB est précédée par la duplication du demi-pont qui consiste en l’assemblage d’un réseau anti-parallèle de Sfi1 et Cdc31. Adapté de Rüthnik et al. 2017

Une étude quantitative de l’intensité de Sfi1 au SPB au cours du cycle cellulaire réalisée au laboratoire a révélé deux phases d’augmentation du signal au cours du cycle cellulaire ; une première phase rapide et de courte durée a lieu, dès l’anaphase jusqu’à la septation; une seconde s’étend sur toute la phase G2. Puis, quand le fuseau s’assemble à l’entrée en mitose, les deux SPBs se séparent. Le signal de chaque SPB correspond alors à 1/3 du signal observé avant séparation. Ceci montre que les demi-ponts sont déstabilisés à l’entrée en mitose et perdent 1/3 des molécules Sfi1.

Par ailleurs, l’utilisation d’un mutant thermosensible de Cdc31 (Ohta et al., 2012) combinée à un système ultra-rapide de changement de température basé sur la microfluidique (Velve Casquillas et al., 2011), montre que la duplication des SPBs a lieu très rapidement en sortie de mitose, coïncidant avec la première phase d’augmentation de Sfi1. Ainsi la première phase correspondrait à la duplication du SPB et aurait lieu en G1.

D’autre part, j’ai étudié les effets de la mutation d’un site potentiel de phosphorylation de Cdc31 par la kinase mitotique Cdk1. Ce mutant (cdc31-S15A) présente un délai de séparation des SPBs à l’entrée en mitose et assemble un fuseau monopolaire transitoire. De plus j’ai démontré que la déstabilisation des demi-ponts, lors de l’entrée en mitose, observée dans une souche sauvage est abolie dans ce mutant. J’ai aussi montré que le complexe Cdk1/CyclineB1 phosphoryle Cdc31 in vitro. Enfin, des expériences d’immuno-precipitation sur celles synchronisées ont permis d’observer que la forme phosphorylée de Cdc31 était enrichie en mitose et que la mutation de la Sérine 15 en Alanine, conduit à la disparition de cette forme phosphorylée.

A partir de ces résultats, nous avons proposé un modèle dans lequel Sfi1 et Cdc31 sont régulées par Cdk1 : la phosphorylation de Cdc31 par Cdk1 à l’entrée en mitose déstabiliserait le réseau Sfi1/Cdc31 pour favoriser la séparation des SPBs, alors que l’inactivation de Cdk1 en sortie de mitose provoquerait la duplication du demi-pont (Fig. 4).

Figure 4 – Modèle de la fonction de Sfi1 et Cdc31 dans le contrôle de la duplication et la séparation des SPBs