Rôle des protéines MAP6 sur les réseaux d'actine: étude in vitro

Contexte

L'actine constitue avec les microtubules l'un des constituants majeurs du cytosquelette des cellules eucaryotes et va se retrouver impliquée dans de nombreux processus de motilité cellulaire comme la mise en place de structure comme les lamellipodes ou encore les filopodes. L'actine va ainsi jouer par exemple un rôle important dans la mise en place et la guidance du cône de croissance dans les cellules neuronales lors du développement.

Cependant, l'actine peut également jouer un rôle dans le maintien de certaines structures, comme par exemple les épines dendritiques (Ramon et al., 1888). Les épines dendritiques constituent des excroissances de la membrane des dendrites dans les neurones pouvant aller de 1 à 2 μm délimitées à leur base au niveau du dendrite par un rétrécissement de la membrane plasmique constituant le cou de l'épine dendritique. Cette structure particulière leur permettent de jouer un rôle important dans la transmission synaptique en recevant les signaux cellulaires des axones de neurones présynaptiques mais également un rôle de compartimentation et de régulation de cette transmission au niveau du cou de l'épine dendritique (Araya et al., 2006).

Bien que longtemps considérée comme figée rapidement après la naissance, les épines dendritiques témoignent au contraire d'une grande plasticité structurale, plasticité qui va jouer un rôle prépondérant au cours de l'apprentissage. Il a ainsi été montré que les épines dendritiques subissent continuellement des changements de forme et des turn-over permanents (Matsuzaki et al., 2004 ; Toni et al., 1999 ; Segal, 2005). Cette plasticité est influencée par l'activité neuronale mais également augmentée lors d'expériences de potentialisation à long terme (LTP) consistant en l'augmentation de l'efficacité synaptique après une stimulation importante des régions pré-synaptiques (Holtmaat et al., 2006 ; De Roo et al., 2008 a ; De Roo et al., 2008 b), plasticité médiée entre autre par un remodelage des filaments d'actine. L'actine va ainsi avoir à la fois un rôle dans le maintien de la structure des épines mais également dans la plasticité de ces dernières (Fischer et al., 1998).

De façon intéressante, des altérations de la structure des épines dendritiques ou encore de leur dynamicité ont été mis en évidence dans les phases précoces des maladies neurodégénératives comme la maladie d'Alzheimer ou la maladie de Parkinson mais aussi dans les maladies psychiatriques comme l'autisme ou la schizophrénie. Ces défauts de fonctionnement des épines dendritiques sous-tendent les troubles cognitifs (apprentissage, mémoire), symptômes communs à ensemble de ces maladies neuronales (Fuhrmann et al., 2007 ; Toro et al., 2010 ; Blanpied and

Ehlers, 2004 ; Kasai et al., 2010 ; Melom and Littleton, 2011 ; Wong et Guo, 2013).

Comme nous l'avons vu précédemment, il a été montré chez des souris KO pour MAP6 que la perte de la protéine entraînait des troubles comportementaux accompagnés de sévères défauts de plasticité synaptique (Andrieux et al., 2002). De plus le spectre des déficits présents chez la souris MAP6 KO ainsi que leur réactivités aux antipsychotiques permettent de proposer ce modèle animal comme un modèle utile pour l'étude de la schizophrénie.

Dans ce contexte nous nous sommes demandé au sein du laboratoire si les défauts observés dans les souris KO MAP6 pouvaient impliquer, comme dans le cas des maladies psychiatriques une altération de la morphologie et/ou de la dynamicité des épines dendritiques.

Ainsi, des études réalisées au sein du laboratoire par Leticia Peris et Mariano Bisbal sur des neurones primaires d'hippocampe de souris en culture ont montré que la délétion de la protéine MAP6 dans ces neurones entraine une perte significative de la densité d'épines dendritiques à la surface du neurone. De la même façon, l'utilisation d'ARNs anti-sens dirigés contre la protéine MAP6 engendre une diminution de cette densité. De plus, des expériences d'activation des neurones (LTP chimique) ont montré que l'absence de la protéine MAP6 entraîne une perte de la stabilisation de l'actine, dans les épines en réponse à la LTP. En accord avec ces résultats, la ré-expression de la protéine MAP6 dans des neurones déplétés pour la protéine permettait un rétablissement de la densité d'épines au même niveau que le contrôle ainsi que le rétablissement de la stabilité de l'actine dans les épines en réponse, à une LTP chimique.

Ainsi dans le cas de la souris KO MAP6, les défauts observés semblent impliquer, comme pour les autres maladies et pathologies décrites précédemment, des altérations de la stabilité et de la dynamicité des épines dendritiques.

De façon à déterminer quelles régions de la protéine pouvaientt être impliquées dans le phénotype observé, de nombreuses constructions ont été testées sur ces neurones afin de rétablir la densité d'épines. De façon surprenante, il a ainsi été montré que la région centrale de la protéine MAP6, contenant les domaines de liaisons aux microtubules au froid (modules Mc), permettait un rétablissement du phénotype.

Lorsque le cDNA codant pour les modules Mc de MAP6 à été transfecté dans des cellules Hela (dépourvue de MAP6) nous avons eu la surprise de voir une co-localisation avec l'actine. La caractérisation d'une éventuelle interaction directe entre ces modules Mc et l'actine a été entreprise.

Résultats

Dans un premier temps, nous avons testé une possible interaction directe de la protéine MAP6 avec l'actine in vitro en pellet assay. Nous avons ainsi montré que la protéine MAP6-N pouvait intéragir de façon directe avec les filaments d'actine. L''interaction des modules Mc avec l'actine semble être beaucoup moins forte que celle de la protéine entière (figure 1). Toutefois, une centrifugation à plus faible vitesse (15 000g au lieu de 100 000g) après l'interaction des protéines avec l'actine a permis de montrer que la protéine MAP6-N ainsi que les modules Mc étaient capables d'induire la formation de faisceaux d'actines (qui ne peuvent pas se former uniquement avec de l'actine G) montrant également la capacité des modules Mc à interagir avec l'actine pour former des faisceaux. De façon à quantifier la formation de ces faisceaux, diverses concentration de Mc ont été appliqués à l'actine filamenteuse. La formation de ces faisceaux semble ainsi atteindre un plateau à partir d'une certaine concentration de MAP-N (221-445) (environ 250 à 500 nM pour 2 μM d'actine G) (figure 2).

Afin de nous assurer que l'actine dans le culot obtenue à 15000 g correspond bien à de l'actine en faisceau et non à une agrégation de filamens d'actine, nous avons par la suite regardé la polymérisation de l'actine G en TIRF en présence ou en absence des modules Mc (MAP6-N 221-445). Ainsi en absence des modules Mc, l'actine polymérise, reste labile dans le champ du TIRF et les filaments ne s'associent pas pour former des faisceaux. Au contraire, la présence des modules Mc induit la formation de faisceaux, indiquant que les modules Mc sont capables d'interagir avec les filaments d'actine pour les assembler en faisceaux.

Figure 1 : Interaction des protéines MAP6-N et MAP6-N (221-445) avec les filaments d'actine

Les filaments d'actine ont été prépolymérisés avec 2μM d'actine G puis mis à incuber avec ou sans les différentes protéines MAP6-N et MAP6-N(221-445) à 1μM, puis centrifugés. (A) Les filaments d'actine ont dans un premier temps étaient centrifugés à 100 000g et les surnageants (Sn) et culot (P) déposés sur gel afin de mettre en évidence une intéraction directe entre les filaments et les protéines. (B) Dans un second temps les filaments ont été successivement centrifugés à 15 000g (P₁₅) pour centrifuger uniquement les faisceaux d'actine puis à 100 000g (P₁₀₀) pour centrifuger les filaments simples.

De façon intéressante, les modules Mc furent initialement décrits comme étant capable de lier et de stabiliser les microtubules au froid et sont incapables de lier les microtubules à 37°C.

MAP6-N MAP6-N (221-445)=R1-R5 Mc Actine MAP6-N (221-445) MAP6-N (221-445) + Actine Sn P₁₅ P₁₀₀ Sn P₁₅ P₁₀₀ Sn P₁₅ P₁₀₀ Sn P₁₅ P₁₀₀ Sn P₁₅ P₁₀₀ Actine MAP6-N+ Actine MAP6-N MAP6-N (221-445) MAP6-N (221-445) + Actine Sn P Sn P Sn P Sn P Sn P

Actine ^MAP6-N+ _Actine MAP6-N

MAP6-N MAP6-N (221-445) Actine

A

B

Figure 2 : Ativité de formation de faisceaux par la protéine MAP6-N (221-445)

(A) Les filaments d'actine ont été prépolymérisés et incubés avec différentes concentration de MAP6-N (221-445) avant d'être centrifugés à 15 000g. Les culots ont ensuite été déposé sur gel acrylamide 10% (partie gauche du gel). La concentration totale de MAP6-N (221-445) (Mc) utilisée pour chaque conditions lors de l'incubation à était déposée sur la partie droite du gel. La quantité d'actine centrifugée à par la suite était rapporté à la quantité d'actine G initiale (en utilisant le logiciel image J) pour déterminer le pourcentage d'actine en faisceaux (B). Le graphique représente la valeur moyenne et les barres d'erreurs la déviation standart d'au moins 4 expériences différentes. (C) Image en microscopie TIRF représentant l'aspect des filaments d'actine en présence de concentration croissante de MAP6-N (221-445). 0nM MAP6-N (221-445) Actine 2μM Actine MAP6-N (221-445) Concentration MAP6-N (221-445) (μM) 0,⁰⁵ 0,¹ 0,²⁵ 0,⁵ 1 2 0,⁰⁵ 0,¹ 0,²⁵ 0,⁵ 1

A

C

B

De plus, le nombre de répétitions des modules Mc au sein des espèces peut varier de 1 pour l'homme à 9 pour certains rongeurs et il existe une corrélation entre le nombre de modules Mc et la

capacité à faire de la torpeur ou à hiberner (Delphin et al., 2012). Un seul domaine Mc n'est pas

capable de stabiliser les microtubules au froid (Bosc et al., 2001)

Ainsi, le rat possède 5 modules Mc au sein de la protéine MAP6 tandis que chez l'homme, seul le dernier module Mc, appelé R5, est présent. De plus ce module se retrouve être une répétition légèrement dégénéré par rapport aux 4 autres modules chez le rat. Nous nous sommes ainsi demandé si un seul module Mc était capable d'interagir avec l'actine pour former des faisceaux ou si deux modules étaient nécessaires pour faire le lien entre deux filaments d'actine.

Ainsi une expérience de pellet assay a été réalisée avec la protéine MAP6-N(360-451), exprimant les modules R4R5 ou avec la protéine MAP6-N(157-202) exprimant seulement le module R5. Nous avons ainsi pu montrer que 2 modules Mc sont toujours capable de former des faisceaux d'actines et de façon intéressante, le module R5 est également capable de former des faisceaux. La formation des faisceaux ne passerait donc pas par une répartition des modules Mc entre les filaments d'actine mais soit par une capacité de chaque module Mc à lier plusieurs filaments d'actine ou bien par une interaction entre les différents module Mc.

Le module R5 est présent chez l'homme indiquant que l'effet de MAP6 sur l'actine au sein des épines est possiblement un mécanisme également actif chez l'homme.

Figure 3 : Activité de formation de faisceaux d'actine par les les protéines MAP6-N(360-451) et MAP6-N(157-202).

Les filaments d'actine ont été prépolymérisés avec 2μM d'actine G puis mise à incuber avec ou sans les différentes protéines MAP6-N(360-451) et MAP6-N(157-202) à 1μM, puis centrifugés. Les filaments ont étaient successivement centrifugés à 15 000g (P

15) pour centrifuger uniquement les faisceaux d'actine afin de mettre en évidence une capacité de formation de faisceaux des protéines, puis à 100 000g (P ) pour centrifuger les filaments simple.

Actine 2μM Sn ^P15 P₁₀₀ Sn ^P100 Sn ^P15 P_{100 Sn} P₁₅ P₁₀₀ Sn P₁₅ P₁₀₀ Actine Actine MAP6-N(157-202) MAP6-N(360-451) P₁₅

Conclusion

La protéine MAP6 semble donc être un acteur majeur de la régulation de l'actine et des études complémentaires détermineront le rôle exact de la protéine MAP6-N sur l'ensemble des aspects de cette dynamique (nucléation, bundling, stabilisation). De plus les régulateurs de l'actine comme la profiline contiennent des domaines SH3 qui lient de nombreux domaines PRD, la protéine MAP6 contenant plusieurs PRD on peut imaginer, en sus des régulations directes identifiées ici, des régulations indirectes de la dynamique de l'actine, par MAP6.