Rôle de la PKA dans l’activation de la PFK-2

a.PKA et phosphorylation de la PFK-2

Dans le foie, le glucagon stimule la PKA, qui va phosphoryler la Ser³² de l’isoenzyme hépatique de la PFK-2. Il en résulte l’inactivation de la PFK-2 au profit de l’activation de la phosphatase FBPase-2 (Rider et al., 2004) en favorisant la gluconéogénèse. Il en est tout autrement dans le cœur: l’insuline va stimuler la glycolyse par une augmentation du transport du glucose puis l’activation de la PFK-2 cardiaque. La phosphorylation de la PFK-2 est assurée par plusieurs kinases et majoritairement par la PKA (El-Maghrabi et al., 1982). En

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effet, celle-ci va prendre en charge les résidus Ser⁴⁶⁶ et Ser⁴⁸³ de la PFK-2 et participe donc à l’activation de l’isoenzyme dans le cœur (Rider et al., 2004).

b.PKA et activation de la NADPH oxydase

Lors de l’activation des PMN, le cytochrome b₅₅₈ ainsi que les facteurs cytosoliques sont phosphorylés par des protéines kinases. Ces phosphorylations sont primordiales pour l’activation du complexe de la NADPH oxydase sans quoi la production de ROS serait impossible. Dans les PMN, lors de la stimulation des cellules, p47-phox va être phosphorylée par la PKC (5 résidus sérine) et par la PKA (3 voire 4 résidus sérine). Cependant, l’action de la PKA seule ne permet pas l’activation de la NADPH oxydase phagocytaire. En effet, dans certaines conditions l’augmentation de l’AMPc dans les PMN peut inhiber la production de ROS. La PKA semble être un régulateur négatif de la NADPH oxydase en inhibant l’assemblage du complexe (Kramer et al., 1988).

I.2.2. Expression de la PKA dans les PMN

L’expression de la PKA dans les PMN a été analysée par Western blot sur des échantillons de cytosols et de membranes de PMN humains. Les résultats obtenus montrent que la PKA (40 kDa) est présente dans le cytoplasme (Figure 23A) des PMN et est absente de la membrane (Figure 23B).

Figure 23: Analyse de l’expression de la PKA dans les PMN. Western blot de la PKA réalisé sur un échantillon de cytosol (A) et un échantillon de membrane (B) de PMN. L’immunodétection de la PKA est effectuée avec l’anticorps anti-PKA (Santa Cruz Biotechnology, inc) dilué au 1/500. Celui-ci est révélé à l’aide d’un anticorps d’âne anti-IgG de lapin (GE, Healthcare®) dilué 1/5000 couplé à une péroxydase (HRPO).

I.2.3. Impact de la PKA sur l’activation de la PFK-2 dans les

pseudo-neutrophiles

Dans un premier temps, l’implication de la PKA dans la phosphorylation de la PFK-2 a été étudiée dans les cellules PLB-985 différenciées en pseudo-neutrophiles. Pour cela, les cellules ont été incubées en présence de l’inhibiteur pharmacologique de la PKA, H-89 (10 µM) avant d’être stimulées avec le PMA (130 nM), la ionomycine (2 µM) ou le fMLP (100 mM). Les

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cellules sont fractionnées en cytosol et membranes. Les échantillons de cytosol sont préparés et séparés par électrophorèse sur gel SDS-PAGE 10 %. Après transfert sur membrane de nitrocellulose, le degré de la phosphorylation de la PFK-2 est analysé par Western blot avec l’anticorps anti-phosphoPFK-2 spécifique de la sérine 466 (Santa Cruz Biotechnology). Une augmentation très nette de la phosphorylation de la PFK-2 est observée dans les cellules stimulées quel que soit le stimulus employé (PMA, ionomycine, fMLP) (Figure 24B).

Figure 24: Analyse de la phosphorylation de la PFK-2 dans les cellules PLB-985 différenciées. Les cellules (5×10⁷ cellules/mL) sont incubées en présence de DMSO (0,1 %) ou de H-89 (10 µM) pendant 30 min à 37 °C. Après centrifugation (350 g / 10 min / 20 °C) et lavage avec du PBS, les cellules sont divisées en quatre groupes : non stimulées (ns), PMA (130 nM), ionomycine (2 µM) et fMLP (100 nM). La concentration cellulaire est préalablement ajustée à 2×10⁶ cellules/mL et la stimulation est effectuée pendant 5 min à 37 °C. Une fois la stimulation terminée, les cellules sont fractionnées. Les cytosols sont utilisés pour effectuer des Western blot de la PFK-2 phosphorylée à raison de 100 µg par dépôt (A). La PFK-2 phosphorylée a été détectée avec l’anticorps anti-pPFK-2 (Ser 466) (Santa Cruz Biotechnology, Inc) dilué au 1/500. (B) Histogrammes correspondant à l’analyse densitométrique de la phosphorylation de la PFK-2 des Western blots présentés en A. L’expression de la PFK-2 phosphorylée a été normalisée par rapport à l’expression de p40-phox, détectée à l’aide d’un anticorps polyclonal anti-p40, développé au laboratoire. Les valeurs sont exprimées en pourcentage du contrôle DMSO 0,1% non-stimulé. Les données des histogrammes sont représentatives de trois expériences réalisées sur des préparations indépendantes.

Ces résultats sont confirmés par l’analyse densitométrique des Western blots (Figure 24B). Le traitement des cellules avec l’inhibiteur pharmacologique de PKA (H-89) réduit fortement

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la phosphorylation de la PFK-2 induite par la stimulation par la ionomycine ou le fMLP. La diminution de la phosphorylation est également observée avec les cellules stimulées par le PMA mais l’effet est moins important. L’analyse densitométrique du Western blot confirme la diminution de la phosphorylation de la PFK-2 observée dans les pseudo-neutrophiles traités avec l’inhibiteur de la PKA.

I.2.4. Impact de l’inhibition de la PKA sur l’activité NADPH

oxydase

La PKA est impliquée dans la phosphorylation de la PFK-2 dans les PMN stimulés. Des résultats préliminaires obtenus au laboratoire montrent que la PFK-2 activée participerait à la régulation de l’activité NADPH oxydase. Des cellules PLB-985 différenciées ou des neutrophiles humains ont été traités avec l’inhibiteur pharmacologique de la PKA, H-89, puis stimulés avec le fMLP, un activateur physiologique de la NADPH oxydase. L’activité NADPH oxydase de ces cellules a été mesurée par chimiluminescence.

Figure 25: Activité NADPH oxydase mesurée par chimiluminescence dans les cellules PLB-985 différenciées et les PMN. Les cellules PLB985 différenciées (A) ou les PMN humains (B) sont incubés en présence de DMSO 0,1 % ou de H-89 10 µM pendant 30 min 37 °C. La concentration cellulaire est ajustée à 5×10⁷ cellules/mL. Les cellules sont centrifugées (350 g / 10 min / 20 °C) puis lavées avec du PBS. L’activité NADPH oxydase des cellules est ensuite mesurée par chimiluminescence pendant 30 min. (A) Histogramme représentant l’activité NADPH oxydase totale des PLB-985-différenciées en pourcentage du contrôle, et des PMN humains en RLU. (B) Graphes correspondant à la cinétique de l’activité NADPH oxydase des PLB-985-différenciées et des PMN, exprimée en RLU. *P<0,05 (traitement DMSO comparé au traitement H-89). (n=3).

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Dans les cellules PLB-985 différenciées, une diminution significative de la production de ROS en réponse à une stimulation par le fMLP est observée dans les cellules traitées par l’inhibiteur pharmacologique de la PKA (Figure 25A). Cette diminution est également visible dans les cellules non-stimulées.

L’inhibition de la PKA dans les PMN humains conduit également à une diminution faible mais significative de la production de ROS en réponse au PMA (Figure 25B), mais pas dans les cellules traitées par le fMLP. Si nous regardons la cinétique de production des ROS dans les PMN stimulés par le PMA après traitement par l’inhibiteur de la PKA, nous observons deux effets (Figure 25B) :

- Une production plus rapide et plus importante des ROS dans les premières minutes par rapport aux cellules non traitées.

- Une production qui s’arrête prématurément par rapport aux cellules non traitées.