Rôle de Pax6 dans la génération des astrocytes et des cellules de Müller de la

À la lumière du rôle de Pax6 dans la génération des astrocytes du cortex cérébral, nous avons voulu analyser l’effet de la mutation conditionnelle de ce gène dans la génération des cellules astrogliales d’une autre région du système nerveux central, la rétine. La rétine comprend deux types de cellules astrogliales, les cellules de Müller348 et les astrocytes349,350. Les cellules de Müller sont des cellules bipolaires radiales qui traversent

l’épaisseur entière de la rétine et dont le noyau est situé dans la couche nucléaire interne. Ces cellules sont distribuées de façon homogène dans la rétine et projettent leurs prolongements dans les deux directions, vers la membrane limitante externe et vers la membrane limitante interne. Les prolongements s’insinuent entre les corps cellulaires des neurones dans les couches nucléaires et enveloppent des groupes de prolongements neuronaux dans les couches plexiformes. Les cellules de Müller sont produites par les progéniteurs neuroépithéliaux rétiniens16.

Les astrocytes ont une forme étoilée et se trouvent dans la couche des cellules ganglionnaires et dans la couche des fibres nerveuses, où leurs prolongements sont disposés parallèlement et entre les faisceaux de fibres nerveuses350. Le nombre d’astrocytes est proportionnel à l’épaisseur de la couche des fibres nerveuses. Ils sont distribués en correspondance avec des vaisseaux sanguins qui vascularisent la rétine349,351_{. Les astrocytes}

rétiniens dérivent de progéniteurs cérébraux qui migrent dans la rétine à travers le nerf optique352.

Pour déterminer si Pax6 joue un rôle dans la génération des cellules astrogliales rétiniennes, un marquage par immunohistochimie pour GFAP dans la rétine des souris mutante et contrôles de 16 jours a été effectué (Figure 20). La rétine des souris contrôles wild-type et hGFAP-CRE présente un faible marquage dans la couche nucléaire interne et dans la couche plexiforme externe, correspondant aux prolongements radiaux des cellules de Müller (les prolongements sont plus évidents sur toute l’épaisseur de la rétine chez la souris hGFAP-CRE) et un marquage évident dans les couches des cellules ganglionnaires et des fibres nerveuses, en correspondance des astrocytes. La rétine de la souris mutante hGFAP-CRE/ Pax6flox/flox présente un marquage beaucoup plus faible dans les couches nucléaire interne et plexiforme externe comparativement aux contrôles, et présente quelques cellules très faiblement marquées dans les couches des fibres nerveuses et des cellules ganglionnaires, suggérant que Pax6 joue un rôle dans la différenciation des cellules astrogliales rétiniennes.

Figure 20: Pax6 promeut la différenciation des cellules de Müller et des astrocytes rétiniens.

(A) Représentation schématique d’une section sagittale de l’œil de souris. Le rectangle

rouge montre la région qui a été analysée dans le cadre de notre étude. (B) Section histologique de la rétine de souris colorée à l’hématoxyline montrant les différentes couches rétiniennes. (C) Marquage par immunohistochimie pour GFAP de la rétine d’une souris mutante conditionnelle (hGFAP-CRE /Pax6flox/flox) et de deux contrôles (wt et

hGFAP-CRE), âgées de 16 jours. Les rétines des souris contrôles wild-type et hGFAP-CRE présentent le marquage en correspondance des prolongements des cellules de Müller (flèches jaunes) dans la couche nucléaire interne et dans la couche plexiforme externe (chez la souris hGFAP-CRE, il est possible d’observer les prolongements traversant toute l’épaisseur de la rétine), et des astrocytes dans les couches des cellules ganglionnaires et des fibres nerveuses (flèches noires). Un marquage beaucoup plus faible avec très peu de cellules marquées est visible dans la rétine de la souris mutante conditionnelle, suggérant que Pax6 joue un rôle dans la différenciation des cellules gliales rétiniennes.

Nous avons ensuite effectué le même marquage sur la rétine de souris plus âgées. Afin d’évaluer les effets à long terme de la mutation de Pax6 et de clarifier son rôle dans le développement des cellules de Müller et des astrocytes rétiniens, on a analysé par immunohistochimie l’expression de GFAP dans la rétine de souris de 90 jours (Figure 21). On a utilisé deux souris contrôles (une souris Pax6flox/flox, considérée comme wild-type, et une souris hGFAP-CRE) et une souris mutante conditionnelle hGFAP-CRE/ Pax6flox/flox. Comme dans le cas des souris de 16 jours, la couche des fibres nerveuses et la couche des cellules ganglionnaires des rétines des souris contrôles présentent des astrocytes marqués pour GFAP (flèches noires); la rétine de la souris mutante conditionnelle hGFAP-CRE/ Pax6flox/flox présente elle aussi de nombreux astrocytes positifs pour GFAP dans les mêmes régions, différemment des résultats observés chez la souris mutante plus jeune, qui ne présente qu’un faible marquage (Figure 21). Pour ce qui concerne les cellules de Müller, dans la rétine des souris contrôles, on observe un patron de marquage variable (flèches jaunes): la rétine Pax6flox/flox présente un marquage plus concentré dans la couche plexiforme externe, alors que la rétine hGFAP-CRE a un marquage plus faible dans cette région mais présente des prolongements positifs dans la couche plexiforme interne. La rétine hGFAP-CRE/ Pax6flox/flox présente un marquage faible dans la couche plexiforme externe mais elle exhibe plusieurs prolongements positifs pour GFAP dans la couche nucléaire interne et dans la couche plexiforme interne. Ces résultats montrent donc qu’à l’âge de 90 jours, la rétine de la souris mutante conditionnelle possède des cellules astrogliales différenciées. En comparant les marquages effectués sur les rétines des souris de 16 et 90 jours, on peut donc observer que le défaut de maturation des cellules astrogliales observé chez le mutant plus jeune ne persiste pas à un âge plus avancé: l’absence de Pax6 dans les progéniteurs gliaux exprimant GFAP n’empêche pas la génération des cellules astrogliales dans la rétine, mais leur maturation est ralentie, suggérant ainsi que Pax6 joue un rôle dans le processus de différenciation et de maturation de ces cellules.

Pax6 flox/flox_{(wt) hGFAP:CRE} hGFAP:CRE/ Pax6 flox/flox

GFAP

Figure 21: La rétine de la souris mutante conditionnelle hGFAP-CRE/ Pax6flox/flox présente des astrocytes et des cellules de Müller matures à l’âge de 90 jours.

Marquage par immunohistochimie pour GFAP de la rétine d’une souris mutante conditionnelle (hGFAP-CRE /Pax6flox/flox) et de deux contrôles (Pax6flox/flox, considéré comme wild-type et hGFAP-CRE), âgées de 90 jours. Les rétines des trois génotypes présentent des astrocytes positifs pour GFAP dans les couches des fibres nerveuses et des cellules ganglionnaires (flèches noires). Les trois génotypes présentent également des prolongements des cellules de Müller positifs pour GFAP (flèches jaunes).

Discussion

Pax6, un facteur de transcription hautement conservé parmi les vertébrés et les invertébrés239, est essentiel pour le développement embryonnaire de différents tissus239,255. Il joue un rôle dans la régionalisation du système nerveux central283,299, et régule la prolifération des cellules souches neurales et leur différenciation en neurones281. Notre étude montre que Pax6 est impliqué dans le développement des astrocytes dans le système nerveux central. Nos résultats suggèrent que, dans la phase gliogénique du développement du système nerveux central, Pax6 contrôle la prolifération des cellules souches neurales embryonnaires et promeut leur différenciation en astrocytes. Nous montrons également que, lors du développement post-natal, Pax6 est requis pour la production des astrocytes et pour leur maturation.

1. Rôle de Pax6 lors de la différenciation astrocytaire des cellules