II. Rôle fonctionnel de miR-135a
3. Rôle de miR-135a dans les processus de prolifération, apoptose migration et invasion de
a- Rôle de miR-135a dans le cycle cellulaire, la survie, la mort, la migration
et l’invasion des cellules PC-3
L’étude des gènes dérégulés par la surexpression de miR-135a, réalisée précédemment,
indique que ce miARN peut être impliqué dans la régulation du cycle cellulaire, ainsi que des
processus de prolifération, survie, mort et migration cellulaires. Afin d’étudier la contribution
de miR-1γ5a dans ces différents processus, nous avons analysé l’effet d’une surexpression de
miR-135a sur le comportement des cellules PC-3. Ces cellules ont été choisies car ce sont des
cellules prostatiques tumorales dotées de capacités de migration et d’invasion.
Dans les cellules PC-3 surexprimant miR-1γ5a, nous n’avons pas observé de
changement dans la répartition des cellules dans les différentes phases du cycle cellulaire,
bien qu’une très légère diminution du pourcentage des cellules en phase G2-M soit observée,
dans les cellules transfectées par miR-135a par rapport au miR-NC (Figure 25A). Une
analyse spécifique du pourcentage des cellules en prolifération par marquage BrdU confirme
que la surexpression de miR-135a ne modifie pas les capacités de prolifération des cellules
PC-3 (Figure 25B).
L’analyse de la viabilité cellulaire par quantification de l’ATP cellulaire permettant de
déterminer le nombre de cellules vivantes en culture, indique que miR-135a ne semble pas
non plus être impliqué dans ce processus (Figure 25C). En effet, une surexpression de
miR-135a ne modifie pas la répartition des cellules en culture entre cellules vivantes, en apoptose
précoce, en apoptose tardive ou en nécrose, déterminée par un double marquage DIOC6-PI
(Figure 25D). Plus précisément, les cellules PC-3 surexprimant miR-135a présentent une
activité Caspase 3 identique à celle des cellules contrôles, démontrant que miR-135a ne régule
pas les mécanismes induisant l’apoptose cellulaire (Figure 25E).
En revanche, les cellules PC-3 transfectées avec miR-135a présentent une diminution
des capacités de migration par rapport aux cellules transfectées avec miR-NC (Figure 25F).
observe que la surexpression de miR-135a entraîne une diminution de la vitesse de fermeture
de la blessure.
La transfection de miR-135a induit également une diminution du nombre de cellules
capables de traverser une couche de matrigel, indiquant que miR-135a inhibe les capacités
d’invasion cellulaire (Figure 25G).
En conclusion, l’ensemble de ces résultats indique que miR-135a joue principalement
Les cellules PC-3 ont été transfectées avec miR-135a mimic ou le contrôle négatif miR-NC. Les données représentent la moyenne + écart-type de 3 expériences indépendantes.
A. Pourcentages de cellules dans les différentes phases du cycle cellulaire détérminés après marquage à l’Iodure de Propidium (PI) et analyse par cytomètrie de flux.
B. Pourcentages de cellules en prolifération mesurés par l’incorporation de Bromodéoxyuridine (BrdU) dans l’ADN nouvellement synthétisé et analysés par cytomètrie de flux.
C. Viabilité cellulaire mesurée par analyse au luminomètre de l’ATP cellulaire permettant de déterminer le nombre de cellules métaboliquement actives. La quantification de la viabilité cellulaire est exprimée en pourcentage relatif par rapport à celle des cellules transfectées par le miR-NC.
D. Mesure de l’apoptose cellulaire par double marquage DIOC6-PI et analyse par cytomètrie de flux.
E. Activité de la caspase 3 mesurée par analyse au fluorimètre du substrat DEVD-AFC clivé par la caspase 3. La transfection de Bax est utilisée comme contrôle positif d’apoptose cellulaire.
F. Analyse par vidéo-microscopie de la migration cellulaire par un test de comblement de blessure. La quantification de la vitesse de fermeture de blessure est exprimée en pourcentage relatif par rapport à celle des cellules transfectées par le miR-NC. Des images représentatives de fermeture de la blessure sont présentées à 0 h, 10 h et 20 h (barre = 100 µm).
G. Invasion cellulaire. Le pourcentage des cellules invasives a été déterminé par (nombre de cellules passant la membrane recouverte de Matrigel / nombre de cellules ayant migré à travers la membrane) x 100. La quantification des cellules invasives est exprimée en pourcentage relatif par rapport à celle des cellules transfectées par le miR-NC. Des images représentatives des cellules, marquées au DiI, ayant traversé l’insert recouvert de Matrigel sont présentées (barre = 100 µm).
b- miR-135a cible les ARNm de ROCK1 et ROCK2
Parmi les gènes sous-exprimés dans les cellules transfectées avec miR-135a, impliqués
dans les processus de mouvement cellulaire et ayant un site de liaison potentiel de miR-135a,
nous avons retenu ROCK1. Cette protéine kinase, appartenant à la voie de signalisation de
Rho, est impliquée dans les processus d’organisation du cytosquelette, de migration et
d’invasion cellulaire. De plus, le second membre de la famille des ROCKs, ROCK2, dont la
séquence et la fonction sont très proches de celles de ROCK1, est également prédit pour être
une cible de miR-135a, selon TargetScan. Nous avons donc décidé d’évaluer le rôle de miR
-1γ5a sur l’expression et la fonction de ROCK1 et ROCKβ.
Nous avons confirmé l’effet de la surexpression de miR-135a sur la régulation de
l’expression de ROCK1 et ROCKβ, au niveau transcriptionnel et protéique par des analyses
de RT-PCRq et Western Blot, respectivement. Les cellules LNCaP transfectées pendant 48 h
avec miR-1γ5a présentent une diminution d’environ 50% du taux d’ARNm de ROCK1 et
ROCK2, par rapport aux cellules transfectées avec le contrôle négatif miR-NC (Figure 26A).
De plus, une forte diminution du taux de protéines ROCK1 et ROCK2 (de 96% et 80%
respectivement, Figure 26B) a été observée, 48 h après la transfection de miR-135a.
Nous avons ensuite étudié l’interaction directe entre miR-135a et les ARNm cibles
potentiels de ROCK1 et ROCK2. Nous avons généré des plasmides contenant une partie de la
γ’UTR de ROCK1 ou ROCKβ en aval d’un gène luciférase (wt γ’UTR) et des plasmides avec
des délétions des séquences reconnues par miR-1γ5a (mut γ’UTR) (Figure 26C). Lorsque les
constructions sauvages (wt) sont cotransfectées avec miR-135a dans les cellules HeLa, on
observe une diminution de l’activité luciférase, par rapport au vecteur vide (-57% et -32%
pour les constructions ROCK1 et ROCK2 respectivement; Figure 26D). A l’inverse,
l’expression luciférase des constructions mutantes (mut γ’UTR) n’a pas été affectée par la
surexpression de miR-135a. Ces données révèlent une interaction directe entre miR-135a et la
γ’UTR des ARNm de ROCK1 et ROCKβ.
L’ensemble de ces résultats indique donc que miR-135a régule négativement
l’expression de ROCK1 et ROCK2 et que les ARNm de ROCK1 et ROCK2 sont des cibles
Dans les cellules LNCaP traitées au R1881, dans lesquelles l’expression de miR-135a
est augmentée, nous avons également observé une diminution des quantités protéiques de
ROCK1 et ROCK2 (-74% et -65%, respectivement; Figure 26E), suggérant que les
androgènes régulent négativement l’expression de ces deux protéines à travers la
Figure 26 : miR-135a régule l’expression de ROCK1 et ROCK2 en interagissant avec leur 3’UTR. A. Expression des ARNm de ROCK1 et ROCK2 dans les cellules LNCaP, 48 h après la transfection de miR-135a mimic ou du contrôle négatif miR-NC, déterminée par RT-PCRq. Les données sont présentées sous forme de différentiel d’expression de ces gènes dans les cellules transfectées avec miR-135a, comparées aux cellules transfectées avec miR-NC. Les résultats représentent la moyenne + l’écart-type de trois expériences indépendantes.
B. Analyse par Western Blot de l’expression des protéines ROCK1 et ROCKβ dans les cellules LNCaP, 48 h après transfection de miR-135a mimic ou du contrôle négatif miR-NC. L’expression protéique a été quantifiée
C. Représentation schématique des constructions de plasmide contenant la γ’UTR de ROCK1 ou ROCKβ. Les sites de liaison potentiels de miR-135a identifiés par TargetScan, sont représentés par un carré noir (WT) et les mutants (mut) correspondent à des délétions de la région complémentaire à la séquence seed de miR-135a. D. Interaction de miR-1γ5a avec les γ’UTR de ROCK1 et ROCKβ analysée par des tests rapporteurs luciférase. Des vecteurs pmiRGLO contenant les γ’UTR de ROCK1 ou ROCKβ, sauvages (WT) ou mutées (mut) pour les sites de liaison de miR-135a, sont transfectés dans les cellules HeLa avec miR-135a ou miR-NC. L’activité luciférase a été mesurée 48h après transfection et les résultats sont présentés comme le différentiel de l’activité luciférase dans les cellules transfectées par miR-135a/miR-NC. Les résultats représentent la moyenne + l’écart -type de trois expériences indépendantes.
E. Analyse par Western Blot de l’expression protéique de ROCK1 et ROCK2 dans les cellules LNCaP, 48h après traitement androgénique (R1881) ou après le contrôle négatif à l’éthanol (Eth). Les taux d’expression protéiques ont été quantifiés avec le logiciel MultiGauge et normalisés par rapport à ceux de la -Tubuline. Les pourcentages de diminution correspondent aux taux normalisés de protéines dans les cellules traitées au R1881/Eth.
c- miR-135a inhibe la migration et l’invasion cellulaire en régulant
l’expression des ROCKs.
Comme indiqué précédemment dans la Figure 25F, la transfection de miR-135a dans
les cellules PC-3 induit un retard de migration des cellules en culture lors d’un test de
comblement de blessure. En parallèle, nous avons artificiellement diminué l’expression des
protéines ROCK1 et ROCK2 en co-transfectant siROCK1 et siROCK2, ou en traitant les
cellules avec un inhibiteur chimique des kinases ROCKs, Y-27632. Ces différents traitements
induisent également une inhibition de la migration cellulaire (Figure 27A), suggérant le rôle
de ROCK1 et ROCK2 dans l’inhibition de la migration par miR-135a. Pour confirmer cette
hypothèse, nous avons réintroduit ROCK1 dans les cellules PC-3 surexprimant miR-135a.
Ces cellules retrouvent les capacités de migration similaires aux cellules contrôles (Figure
27A).
L’étude de la morphologie des cellules en migration a confirmé cette hypothèse. Les
cellules transfectées avec miR-135a sont plus allongées que les cellules PC-3 transfectées
avec miR-NC, et sont dotées de multiples protrusions (Figure 27B), un phénotype proche de
celui des cellules transfectées avec les siROCK1/siROCK2 ou traitées avec Y-27632. De
façon intéressante, en forçant l’expression exogène de ROCK1 dans les cellules surexprimant
miR-135a, on restaure le phénotype cellulaire normal, ce qui suggère un rôle collaboratif de
ROCK1 et ROCK2 dans la morphologie et la migration cellulaire.
Enfin, une observation du cytosquelette d’actine par marquage des cellules à la
phalloïdine couplée au TRITC (Tetramethylrhodamine B isothiocyanate), en
immunofluorescence, appuie de telles observations morphologiques. En effet, dans les
cellules transfectées avec miR-135a, on observe plus de cellules allongées que dans les
cellules transfectées avec le contrôle négatif (miR-NC), et ceci à faible ou à forte densité
cellulaire (Figure 27C).
L’ensemble de ces résultats suggère fortement l’implication des protéines ROCKs,
régulateurs du cytosquelette d’actine, dans le rôle de miR-135a sur la migration des cellules
prostatiques tumorales.
Nous avons ensuite analysé la contribution des protéines ROCKs dans l’inhibition de
diminue fortement l’invasion des cellules PC-3. De plus, comme pour la migration cellulaire,
la surexpression de ROCK1 exogène dans les cellules transfectées avec miR-135a, abolit
l’inhibition de l’invasion cellulaire.
L’ensemble de ces résultats indique que miR-135a régule négativement la migration et
l’invasion cellulaire, en ciblant les ARNm de ROCK1 et ROCKβ. L’effet de miR-135a ne
semble pas être spécifique de la prostate puisque nous avons observé des résultats similaires
dans des cellules HeLa (données non présentées).
A. Analyse par vidéo-microscopie de la migration des cellules PC-3, soit transfectées avec le contrôle négatif (miR-NC), miR-135a, siROCK1 et siROCK2 (siROCK1/2) ou miR-1γ5a et l’ADNc de ROCK1, soit traitées avec le Y-27632, lors d’un test de comblement de blessure. La quantification de la vitesse de fermeture de blessure est exprimée en pourcentage relatif dans les cellules traitées par rapport aux cellules contrôles. Des images représentatives de certaines conditions sont présentées (barre = 100 µm)
B. Morphologie des cellules en migration dans les conditions décrites en A. Barre = 50 µm.
C. Observation du cytosquelette d’actine de cellules PC-3 transfectées avec miR-NC ou miR-135a mimic. Les cellules ont été ensemencées à une densité cellulaire faible (0,5.105/puits) ou forte (2.105/puits) et transfectées pendant 48h. L’actine cellulaire a été marquée à la Phalloidine couplée au TRITC. Des images représentatives de chaque condition sont présentées (barre = 50 µm)
Figure 28 : miR-135a diminue les capacités d’invasion des cellules PC-3, via la voie de signalisation des ROCKs.
Test d’invasion cellulaire des cellules PC-3, soit transfectées avec le contrôle négatif (miR-NC), miR-135a, siROCK1, siROCK2 ou miR-1γ5a et l’ADNc de ROCK1 soit traitées avec le Y-27632. Le pourcentage de cellules invasives a été déterminé par : (nombre de cellules traversant la membrane recouverte de Matrigel / nombre de cellules traversant la membrane seule) x 100. Des images représentatives de certaines conditions sont présentées (barre = 100 µm)