A. Caractérisation du mécanisme d’initiation de la traduction virale impliquant DDX3 Des travaux menés par Soto-Rifo et al, montrent que DDX3 est au cœur de la régulation de la traduction du VIH-1 (Soto-Rifo et al., 2012c, 2013a). Nos résultats préliminaires in vitro sont en accord avec ceux observés sur la stimulation de la traduction virale in cellulo. Cependant, ces travaux ont été réalisés en utilisant l’ARN du VIH-1 entier et rendent compte de l’effet de DDX3 sur la traduction virale globale. Afin de préciser le mécanisme moléculaire impliquant DDX3, il faudrait explorer le rôle potentiel de DDX3 dans l’initiation de traduction du VIH-1 aussi bien dépendant de la coiffe que des séquences IRES. Pour ce faire, la traduction à partir des séquences IRES (IRES5’UTR et IRESgag) seront étudiées en contexte monocistronique et bicistronique.
C’est la comparaison de l’expression protéique dans ces deux contextes qui permettra de déterminer l’implication de DDX3 sur le mécanisme d’initiation coiffe et/ou IRES dépendant. Ces expériences seront dans un premier temps menées in vitro en utilisant la protéine recombinante sauvage et mutée (les mutants sont disponibles au laboratoires, voir matériels et méthodes), ainsi que différents segments de l’ARNg coiffé ou non : la 5’UTR du VIH-1 suivie d’un gène rapporteur, la région codant pour Gag, la 5’ UTR du VIH-1 suivie de la région codant pour Gag ou encore la 5’UTR contenant des mutations/délétions, notamment au niveau de TAR et des motifs impliqués dans l'activité IRES. La dépendance vis-à-vis du facteur eIF4E sera également évaluée en utilisant des analogues de la coiffe qui titre eIF4E. Puis, ex vivo, ces mêmes constructions seront utilisées dans différents types cellulaires déplétée en DDX3.
Ces différentes expériences permettront non seulement de préciser dans quel mécanisme d’initiation de la traduction est impliquée DDX3 mais également d’évaluer si cette implication est dépendante des activités ATPase et hélicase de la protéine.
B. L’interaction DDX3 – ARN du VIH-1
Impact de DDX3 sur la structure de la 5’UTR de l’ARN viral
Il existe plusieurs modèles de structure secondaire de la 5’UTR du VIH-1 et il est vraisemblable que celle-ci évolue au cours du cycle viral en fonction de la concentration cellulaire en ARNg (états monomère-dimère) mais également sous l’influence de facteurs cellulaires et viraux. Soto-Rifo et al, proposent trois sites d’interaction entre l’hélicase cellulaire DDX3 et la 5’UTR du VIH-1 : au niveau de la tige boucle TAR (interaction majeure) et au niveau de régions simple brins situés sur le site de liaison du ARNtlys3 et entre le site majeur donneur d’épissage et le motif Psi ψ d’encapsidation
Afin d’évaluer l’impact de DDX3 sur la structure de la 5’UTR aussi bien sous sa forme monomère que dimère, la protéine sauvage peut être utilisée en présence et en absence d’ATP, mais également en présence d’un analogue non hydrolysable de l’ATP comme l’AMPPNP, ou d’un mutant de DDX3 capable de fixer l’ATP mais incapable de l’hydrolyser (mutant DQAD disponible au laboratoire) de telle sorte à définir l’empreinte de la protéine sur l’ARN. Il serait également intéressant de reproduire ces expériences en utilisant un ARN coiffé, pour déterminer si l’effet de DDX3 sur la 5’UTR est dépendant de la présence de la coiffe.
Détermination du site de fixation de DDX3 sur l’ARN viral
L’affinité de la protéine pour l’ARN viral pourra être déterminée en utilisant la technique de rétention sur filtre. Pour cela des concentrations croissantes de la protéine sont incubés en présence de l’ARN viral. L’implication de la coiffe peut être évaluée en comparant l’affinité de la protéine pour un ARN coiffé et un ARN non coiffé.
Le ou les sites de liaison pourraient être précisés en utilisant cette technique et en suivant la même approche de délétion par PCR (mutants de délétions déjà disponible au laboratoire) que celle utilisée pour la définition du site de liaison entre l’ARN viral et la sous-unité ribosomale 40S.
C. Interactions DDX3 avec les facteurs d’initiation de la traduction
Afin de caractériser le mécanisme moléculaire impliquant DDX3, l’une des premières étapes consiste à déterminer la composition des complexes d'initiation de la traduction des ARNm dépendant de DDX3. Pour cela, les complexes d'initiation formés dans un lysat cellulaire sur un ARN cible de DDX3 seront purifiées par chromatographie d'affinité et analysées par Western Blot et / ou spectroscopie de masse.
Une première série de pull down réalisée par un autre membre du laboratoire, montre une interaction de DDX3 avec eIF4G (le fragment p100, délétée du domaine N- terminal de liaison à eIF4E) et confirme les précédents résultats obtenus in vitro et in
cellulo dans le contexte de lymphocytes CD4+ infectées (Soto-Rifo et al., 2012c, 2013a). De même une interaction avec eIF3 a été observée et confirme les résultats d’une étude similaire (Lee et al., 2008b).Aucune interaction avec eIF4E n’a été observée
lors des pull-down ceci est en accord avec les résultats observés in cellulo(Soto-Rifo et al., 2013a) mais en contradiction avec les résultats obtenus par Shih et al. En effet, ces derniers ont identifié un site d’interaction entre DDX3 et eIF4E au niveau du domaine N- terminale de DDX3, où l’on retrouve la séquence consensus YxxxLφ de liaison à eIF4E
(Shih et al., 2008).L’absence d’interaction entre DDX3 et eIF4E tend plutôt à favoriser le
modèle selon lequel DDX3 se substituerait à eIF4E pour permettre l’assemblage du complexe d’initiation au niveau de la coiffe.
Enfin, l’interaction observée entre DDX3 et DHX9 (RHA) conforte l’hypothèse d’un possible rôle de DDX3 dans la traduction d’ARNm dont la 5’UTR présente des structures secondaires stables. Toutefois, des expériences complémentaires s’avèrent nécessaires pour confirmer les résultats obtenus et pour distinguer les interactions directes protéines-protéines des interactions indirectes médiée par exemple par l’ARN. Pour cela, ces expériences seront reproduites en présence de RNAse pour comparer les protéines éluées avec DDX3 aux résultats précédents.
Il est également possible de recourir à des méthodes biophysiques de caractérisation d’interactions protéiques telles que la mesure de fluorescence ou encore la microcalorimétrie.
Il semble également très intéressant de tester l’effet des partenaires protéiques de DDX3 sur ces activités biochimiques.
D. Validation par reconstruction
Afin de disséquer la séquence des évènements requise pour former un complexe d’initiation sur l'ARNg du VIH-1, il faudrait reproduire entièrement l’étape d’initiation in
vitro. Un tel système existe et est utilisé en routine au laboratoire. Les facteurs purifiés
sont ajoutés un par un et à chaque étape, les complexes formés sont caractérisés par toeprint, footprint et gradient de densité. DDX3 pourra être ajouté à ce système
E. Recherche d’ARNm cibles de DDX3
Pour déterminer les ARNm cellulaires dont la traduction est dépendante de DDX3, des expériences de CLIP (Cross Linking and Immunoprécipitation) et de SHAPE-map seront conduites dans des cellules exprimant ou non DDX3. Une fois les cibles ARN déterminés, il serait intéressant de déterminer si cette interaction est directe et d’évaluer l’affinité de la protéine pour ces ARNs ainsi que l’impact de la liaison de DDX3 sur la structure de ces ARNs.