V- Révision, suspension, suppression en cours de droit
4. Rétablissement de la pension initiale / liquidation d’une seconde pension
As primeiras estratégias de isolamento e identificação de produtos naturais eram focadas principalmente em Actinobacterias, na procura por agentes com nenhuma toxicidade em humanos e amplo espectro de ação, ou seja, ativos no combate de infecções causadas por múltiplas espécies de microrganismos, o que tornou a busca muito seletiva, levando ao reisolamento de vários compostos conhecidos e descartou inúmeros outros de baixo espectro.15 Somado a esses fatores, a dificuldade de isolamento, purificação, determinação estrutural e alto custo associado as triagens resultaram, ao final dos anos 70, em um cenário frustrante, desacelerando a descoberta de novas moléculas bioativas. As indústrias farmacêuticas reduziram drasticamente ou anularam seus investimentos e esforços na bioprospecção de produtos naturais, sendo impulsionadas, entre os anos 80 e 90, pela relativa rapidez na obtenção de bibliotecas de compostos sintéticos a partir da química combinatória e química computacional.15,39
Contudo, o avanço nas tecnologias de sequenciamento de DNA, a partir do século XXI, viabilizou o rápido acesso ao genoma completo de diversos organismos. Quando o sequenciamento do genoma de Streptomyces coelicolor A3(2) foi anunciado, o primeiro do gênero, apenas três antibióticos e um pigmento eram conhecidos, enquanto a informação do seu genoma revelou a presença de pelo menos 20 clusters de genes codificando para o metabolismo secundário, incluindo sideróforos, pigmentos, policetídeos e moléculas de sinalização.40 Posteriormente, a publicação do genoma completo de S. avermitilis, conhecida por produzir o agente antiparasitário avermectina, indicou a presença de 30 clusters biossintéticos.41 Diferentes projetos de sequenciamento de Streptomyces revelaram um potencial
biossintético muito mais expressivo do que aquele acessado em cultivos de laboratório esperando para ser descoberto.42
A partir de então, como alternativa aos métodos de triagem tradicionais, surgiu a estratégia de genome mining, guiando cientistas a partir da informação do sequenciamento do genoma na identificação de potenciais linhagens e metabólitos secundários não acessados em condições normais de cultivo em laboratório, estimulando o interesse na triagem por novos produtos naturais.43,44 Além disso, mesmo a investigação de organismos não sequenciados foi reestabelecida, estimulando cientistas a exploras estratégias de cultivos e co-cultivo para induzir a expressão de genes silenciados ou produzidos em baixa concentração.
O acesso às bases de dados contendo inúmeras sequências depositadas permitiram conectar os genes (ou a informação genética) às moléculas obtidas e, apesar da grande diversidade química obtida, observou-se um repertório limitado de enzimas codificadas por cluster (ou conjuntos) de genes responsáveis pela biossíntese de metabólitos secundários com atividade biológica relevante e dentre elas destacam-se as sintases de policetídeos (PKSs), sintetases de peptídeos não ribossomais (NRPSs) e sintases de terpenos.45 Todas essas enzimas possuem sequências de DNA conservadas que foram utilizadas como guias nas triagens, inicialmente, experimentais por Southern blot ou PCR (reação em cadeia da polimerase), e permitiram que muitos genes ditos “crípticos”, “silenciados” ou “órfãos”, codificando enzimas biossintéticas putativas envolvidas na produção de metabólitos secundários, fossem identificados.46–49
Adicionalmente, o genome mining viabilizou o refinamento de metodologias direcionadas a triagem de metabólitos em função, por exemplo, das propriedades físico-químicas ou das especificidades frente a substratos, além de outras como deleção de genes/avaliação do perfil metabólico, expressão heteróloga, reconstituição in vitro e aproximações genomisotópicas (Figura 3), que levaram a descoberta de novos policetídeos, terpenóides e peptídeos não-ribossomais.50,51,60–62,52–59
A estrutura de coeliquelina (peptídeo não ribossomal) foi inicialmente sugerida a partir do cluster de genes anotado de S. coelicolor M145 e um método desenvolvido para predizer a especificidade de incorporação do domínio de adenilação (A) de cada módulo.50 Em seguida, um experimento de deleção de genes, combinado a análise de propriedades físico-químicas do composto, viabilizaram o isolamento e a determinação estrutural correta.51 Já a descoberta da orfamida A,62 um
lipopeptídeo cíclico produzido por Pseudomonas florescens Pf-5, foi direcionada pela previsão in silico das subunidades incorporadas ao longo da biossíntese e a molécula foi identificada a partir da incorporação de precursores isótopo-marcados estáveis adicionados ao meio de cultivo.63
Figura 3. Estratégias via genome mining para obtenção de novos produtos naturais bioativos. (Adaptado de Corre & Challis64)
Outros exemplos de compostos bioativos derivados das vias NRPS/PKS descobertos por estratégias de genome mining incluem a salinilactama A65 de Salinispora tropica CNB-440, guiada pela combinação de previsões do genoma e propriedades físico-químicas (presença de um grupo cromóforo característico na estrutura); chaxamicinas A–D66 via triagem do genoma por PCR; emericelamida A67 via deleção de genes; acetilaszonalenina68 obtida por reconstituição in vitro e, mais recentemente, a taromicina A69 identificada após expressão em organismo heterólogo do cluster de genes silenciado.
Atualmente, existem 171.328 projetos de sequenciamento de genoma completo de diferentes organismos registrados em base de dados (JGI GOLD – Genomes Online Database; disponível em: https://gold.jgi.doe.gov/index - data de acesso: 03 de Julho de 2019), sendo 16.778 projetos completos e publicados, 135.440 drafts permanentes e 18.349 projetos incompletos. O filo Actinobacteria corresponde
Selvagem
Mutante
Deleção de gene e comparação de perfil metabólito Organismo Heteróogo Heterólogo+gene Heterólogo Expressão em Organsimo Heterólogo Abordagem Genomisotópica Marcado Não Marcado Precursor conhecido: Enzimas purificadas Reconstituição in vitro Precursores
Predição de Propriedades Físico-Químicas
Precursores Fe 3+ Fe3+ Novos Produtos Naturais
a 16.399 projetos de sequenciamento, sendo 123 referentes a projetos de sequenciamento de genomas de Streptomyces completos e publicados.
1.3.1. Ferramentas de bioinformática
A facilidade de acesso e o baixo custo associado ao sequenciamento de genomas levaram ao aumento do número de sequências depositadas e ao acúmulo de informações, dificultando as triagens experimentais e “manuais”. Sendo assim, com o intuito de viabilizar a análise in silico de todas essas informações de modo rápido e preciso, ferramentas como BLAST70 e DIAMOND71 foram desenvolvidas para alinhamento de sequências de DNA com base em algoritmos.44
Posteriormente, foram desenvolvidas ferramentas de bioinformática que automaticamente identificam e anotam os clusters de genes codificando enzimas biossintéticas do metabolismo secundário. O mais conhecido e utilizado atualmente é o antiSMASH (antibiotics and Secondary Metabolite Analysis SHell), que foi lançado em 201172 e já está na sua versão 5.0,73 desenvolvido para análise de genomas de bactérias, fungos e plantas. Essa plataforma online e gratuita concentra diferentes ferramentas para alinhamento de sequências (NCBI BLAST+, HMMer74, Muscle75) e comparação das informações para identificação de enzimas putativas.
O MIBiG (Minimum Information about a Biosynthetic Gene cluster)76,77 é outra plataforma de grande importância, conectada recentemente ao antiSMASH, que reúne informações depositadas por cientistas sobre anotações de clusters biossintéticos e suas entidades químicas associadas. Essa ferramenta auxilia na triagem por clusters de genes inéditos, otimiza o processo de mining dos genomas, viabiliza avaliação da variabilidade de clusters de genes biossintéticos (BGC) de acordo com o ambiente, entre outros.
Outras ferramentas de bioinformática podem ser encontradas em uma comunidade online denominada “The Secondary Metabolite Bioinformatics Portal” (disponível em: http://www.secondarymetabolites.org).