Introduction: Les horloges circadiennes, opérantes dans tous les organismes photosensibles, permettent une adaptation au monde extérieur en anticipant les changements environnementaux journaliers. Au cours des dernières décennies, d’importants efforts ont été entrepris afin d’examiner le lien étroit entre l’horloge circadienne et la plupart des aspects physiologiques. Le plus souvent, les études ont été conduites en utilisant des modèles de rongeurs, les études moléculaires sur les oscillateurs périphériques chez l’humain étant minoritaires, dues aux évidentes difficultés que représente la collection de prélèvements répétitifs chez les individus. Puisque le muscle squelettique joue un rôle central dans la régulation du métabolisme corporel, nous avons cherché à caractériser les oscillateurs circadiens opérants dans des myotubes squelettique primaires humain (MSH) in vitro, et à investiguer leurs rôles dans la régulation de la transcription génique, dans la sécrétion de myokines en réponse à l’insuline et dans le métabolisme des lipides. De plus, les approches établies pour cette étude sur l’impact de la machinerie circadienne humaines dans les cellules musculaires squelettiques ont été combinées à un modèle de cellules primaires de muscle lisse (CMLs) isolées à partir d’artères de porc, permettant d’évaluer le rythme circadien dans les CMLs normales ou pathologiques.
Méthodes: Des biopsies de muscle squelettique humain ont été obtenues pour la partie in vitro, à partir du Gluteus maximus et du Rectus abdominus au cours de chirurgies planifiées, et à partir du Vastus lateralis pour la partie in vivo durant un protocole contrôlé, avec le consentement des donneurs.
Les myoblastes squelettiques primaires humain différentiés à partir des cellules satellites isolées ont été cultivés et différentiés en myotubes. Nous avons établi un système expérimental pour enregistrer pendant une longue durée la bioluminescence dans les MSH, en introduisant les gènes rapporteurs circadiens de la luciférase Bmal1-luciférase (Bmal1-luc) et Per2-luciférase (Per2-luc) par transduction lentivirale. En outre, nous avons développé des outils permettant de dérégler l’horloge circadienne dans les cellules de muscle squelettique chez l’adulte par transfection d’ARN interférent ciblant l’ARN CLOCK. Ensuite, en utilisant une procédure expérimentale combinant enregistrement longue-durée de la bioluminescence et collection de milieu issu de la culture de cellules primaires humaines, nous avons évalué la sécrétion basale circadienne d’un large panel de myokines, en présence ou absence d’une horloge fonctionnelle. Un séquençage à très haut débit (RNA-seq) a été réalisé sur des MSH transfectés, soit avec siControl, soit avec siCLOCK, et collectés chaque 2 h durant 48 h après
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synchronisation in vitro, et sur des biopsies de muscle squelettique humain prises chaque 4 h durant 24 h. L’absorption de glucose par les MSH a été mesurée par l’incorporation de 2-deoxy-[3H]-D-glucose avant et après stimulation par l’insuline. Finalement, grâce à des analyses lipidomiques, nous avons investigué les profiles temporels des lipides pendant 24 h dans le muscle squelettique humain in vivo, et dans les MSH in vitro. De plus, ces paramètres expérimentaux ont été appliqués aux CMLs primaires de porc de forme allongées (fusiformes ou « spindle ») et en forme de parallélogramme (« rhomboid »).
Les CMLs ont été cultivées et transduites avec les rapporteurs Bmal1-luc ou Per2-luc pour l’enregistrement circadien de la bioluminescence. L’analyse en temps réel, via la réaction en chaîne par polymérase quantitative (qRT-PCR), des gènes essentiels de l’horloge et des gènes cibles, a été effectuée sur des échantillons synchronisés par la forskoline, et collectés toutes les 4 h entre 12 h et 36 h après synchronisation in vitro. Finalement, un traitement avec du PDGF-BB ou du FGF-2 des CMLs fusiformes a été appliqué pour induire un changement phénotypique vers la forme parallélogramme de CMLs, avec synchronisation et enregistrement de la bioluminescence circadienne.
Résultats: L’analyse de l’expression des rapporteurs bioluminescents a révélé que les MSH synchronisés in vitro avec la forskoline arborent un rythme circadien soutenu avec une longueur de période de 25.29 ± 0.13 h (Bmal1-luc) et 25.20 ± 0.19 h (Per2-luc). En transfectant les MSH primaires avec un petit ARN interférent ciblant CLOCK, une réduction efficace de l’ordre de 80% du niveau de l’ARN messager (ARNm) et de 74% au niveau protéique a été observée, conduisant à une diminution significative de l’amplitude du rapporteur bioluminescent circadien Bmal1-luc. Les oscillateurs moléculaires opérants dans les MSH ont été par la suite caractérisés en mesurant l’expression endogène des transcrits essentiels de l’horloge au cours du cycle de 24h (« around-the-clock ») en utilisant la RT-PCR quantitative. De plus, nous avons démontré que la sécrétion basale d’IL-6, IL-8 et MCP-1 par les MSH synchronisés présentent un profile circadien. En outre, la sécrétion de l’IL-6 et de plusieurs autres myokines est fortement diminuée lorsque l’horloge est perturbée grâce au siCLOCK. Il est important de noter que la captation de glucose par les MSH est réduite en l’absence d’horloges cellulaires fonctionnelles, en condition basale et en réponse à l’insuline, suggérant un rôle essentiel de l’horloge du muscle squelettique humain dans la régulation de la sensibilité à l’insuline. Nous avons aussi démontré que l’horloge circadienne a un impact sur le métabolisme des lipides dans le muscle, avec environ 20% de métabolites lipidiques présentant un profile rythmique dans les biopsies de muscle humain collectées au cours du temps in vivo, et chez les MSH en culture et synchronisés in vitro. Ces
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oscillations sont considérablement atténuées par la perturbation de l’horloge via ARN interférence dans les myotubes primaires. Par ailleurs, notre étude fournit la première analyse transcriptomique circadienne à grande échelle dans le muscle squelettique humain, conduite par séquençage d’ARN (RNA-seq) suivant un protocole similaire in vivo et in vitro, permettant de distinguer les effets de l’horloge circadienne propres à la cellule (« cell-autonomous ») de ceux systémiques sur la transcription dans le muscle. Les gènes impliqués dans la sécrétion de myokines, la réponse à l’insuline et le métabolisme des lipides ont été identifiés, confortant ainsi nos précédentes observations. Remarquablement, l’expression de l’ARNm des gènes essentiels à l’horloge est cohérente avec les pics d’accumulation des lipides in vivo et in vitro et les profiles temporels des lipides sont corrélés avec les profiles des gènes impliqués dans leur biosynthèse. Concernant la partie sur les CMLs, une durée de période significativement plus longue des oscillations du rapporteur Per2-luc a été observée dans les CMLs en forme de parallélogramme, les CMLs traitées avec PDGF-BB et FGF-2 synchronisées in vitro avec de la forskoline, comparé aux contrôles. L’expression endogène des transcrits a révélé une augmentation de la quasi-totalité des gènes essentiels de l’horloge testés ainsi qu’un décalage de phase dans les CMLs en forme de parallélogramme comparé au CMLs fusiformes.
Conclusions: Nous fournissons pour la première fois une preuve que les MSH primaires possèdent des horloges circadiennes autonomes dotées d’une grande amplitude. Collectivement, nos données suggèrent un rôle essentiel pour les oscillateurs endogènes du muscle squelettique humain en régulant la captation de glucose, la sécrétion de myokine et le métabolisme des lipides. Notre modèle pour l’étude du rythme circadien dans les cellules primaires humaines synchronisées in vitro est de la plus grande utilité car il permet de disséquer les effets autonomes des horloges locales sur les oscillations de transcrits et des lipides dans les MSH, et de les séparer des effets centraux induits par les cycles de repos/activité et de la prise alimentaire. En effet, nous démontrons que l’horloge circadienne du muscle possède d’importantes fonctionnalités en l’absence de synchronisateurs externes. De plus, l’approche expérimentale établie dans ce travail a été transposée à l’étude des horloges circadiennes opérantes dans les ilots pancréatiques humain en culture, et peut être adapté à d’autres types cellulaires, cellules primaires ou lignées, pour l’étude de la composition moléculaire des horloges périphériques humaines et de leurs rôles en conditions physiologiques ou pathophysiologiques.
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