3) RESULTATS SUPPLEMENTAIRES
! La Production d’Interleukine 6 par les cellules Hthy Ori irradiées
! Effet des siRNA DUOX1 sur la production d’IL6 dans la lignée Hthy Ori quatre jours post irradiation
! Implication du facteur de transcription Sp-1 dans l’expression radioinduite de la DUOX1 dans la lignée Hthy Ori:
! L’expression de la DUOX1 en réponse aux radiations ionisantes est également retrouvée dans les fibroblastes humains en culture primaire
Mithramycine (19h)
0 Gy 10 Gy
DUOX1
C) DISCUSSION GENERALE :
Depuis leur découverte, les radiations ionisantes sont utilisées de façon croissante dans le domaine médical. La radiothérapie est utilisée dans le traitement de la moitié des cancers chez l’Homme. Cette utilisation a permis de nombreux progrès dans le traitement des cancers, mais elle peut également entraîner des effets secondaires principalement dans les tissus sains qui entourent la tumeur et ce en dépit des efforts fournis pour l’amélioration du rapport bénéfice/risque. La thyroïde fait partie des organes les plus sensibles aux rayonnements ionisants, et l’irradiation est actuellement reconnue comme un facteur de risque dans le cancer de la thyroïde chez l’enfant. Une augmentation de l’incidence des cancers papillaires de la thyroïde a été longuement étudiée chez les patients traités par radiothérapie pendant l’enfance (Ron et coll,1995). En effet, des travaux publiés en 1991 ont montré l’augmentation du risque de cancer thyroïdien dans une cohorte de patients ayant été traités pour des lymphomes hodgkiniens pendant l’enfance (Hancock et coll,1991). Les nombreux travaux réalisés sur les groupes de survivants de l’accident de Tchernobyl et de l’explosion de la bombe atomique à Nagasaki ont établi un lien direct entre l’exposition aux radiations ionisantes et la prévalence des cancers thyroïdiens de type papillaire. De plus, la translocation chromosomique RET/PTC est très augmentée chez les individus ayant développé un cancer radioinduit suite à une exposition thérapeutique ou accidentelle (Rabes, 2000 ; Bounacer 1997, Nikiforov, 1997). L’étude des différents mécanismes impliqués dans la radiocarcinogenèse thyroïdienne doit permettre de mieux comprendre les effets secondaires observés après les traitements radiothérapeutiques.
Rôle de l’irradiation dans la formation du gène de fusion RET/PTC
Les radiations ionisantes induisent l’activation du proto-oncogéne RET par un réarrangement chromosomique. Bien que RET/PTC3 soit le gène chimère le plus fréquent dans les cancers post Tchernobyl, on retrouve majoritairement la forme RET/PTC1 dans les tumeurs liées à une irradiation thérapeutique, et dans les cellules irradiées in vitro (Ito et coll 1993 ; Mizuno et coll 2000 ; Caudill et coll 2005).
L’irradiation génère les espèces réactives de l’oxygène (ROS) par les mécanismes de radiolyse de l’eau. Ainsi l’exposition des fibroblastes humains aux radiations ionisantes induit une production importante de ROS intracellulaire dans les minutes qui suivent l’irradiation (Narayanan et coll, 1997). Il est maintenant admis qu’un déséquilibre dans la balance REDOX est capable de perturber la stabilité génomique de la cellule en générant des dommages oxydatifs (Dayal et coll, 2008). Des travaux réalisés sur des cellules hématopoïétiques ont montré par exemple qu’après irradiation il y a une augmentation de l’oxydation des bases de l’ADN, de la fragmentation des noyaux, ainsi qu’une augmentation de la peroxydation lipidique, suggérant ainsi qu’un stress oxydant radioinduit serait responsable des effets délétères observés (Clutton et coll, 1996). L’ensemble de ces résultats indique que les ROS participent aux dommages à l’ADN radioinduits. Les effets indirects de l’irradiation sont responsables de 70% des dommages observés. Nos travaux montrent que l’H2O2 généré par la radiolyse de l’eau contribue à l’apparition des dommages à l’ADN, des cassures double-brin et des translocations RET/PTC1 dans les cellules thyroïdiennes. De manière intéressante nous observons grâce à l’utilisation d’un vecteur capable de détecter de manière spécifique l’H2O2 nucléaire (Hyper-Nuc), la présence de cette molécule dans le noyau dans les minutes qui suivent l’irradiation. Le même signal est détecté suite à une application exogène d’H2O2. Dans le cas de l’irradiation la détection de l’H2O2 au niveau nucléaire peut s’expliquer par le fait que la radiolyse de l’eau affecte tous les compartiments cellulaires. En revanche, la fluorescence détectée dans le noyau après un traitement exogène d’H2O2 ne peut s’expliquer que par deux hypothèses : soit l’H2O2
extracellulaire diffuse dans la cellule où il va générer des lésions oxydatives, ce qui est improbable en raison des systèmes antioxydants, ou soit l’H2O2 active lui-même un système générateur de ROS qui serait proche du compartiment nucléaire.
Les cassures de l’ADN ne se produisent pas de manière sporadique, mais dans des régions spécifiques du chromosome. La majorité de ces régions correspondent aux sites fragiles. Leur présence a été décrite comme étant corrélée à de nombreux réarrangements chromosomiques présents dans certains cancers. Ces réarrangements seraient impliqués dans les étapes précoces du processus de carcinogenèse. Des travaux récents (Ghandi et coll 2010) ont montré que le réarrangement RET/PTC1 est généré suite à une cassure au niveau de sites fragiles de l’ADN. De nombreux facteurs environnementaux peuvent participer à la
perturbation des sites fragiles comme l’hypoxie (Coquelle et coll 1998), ou la présence de certains agents tel que la caféine (Yunis et coll 1984). Dans l’état actuel de nos connaissances, aucune donnée dans la littérature n’a pu montrer le rôle de l’H2O2 dans les cassures qui se produisent de manière spécifique au niveau des sites fragiles. L’étude du rôle de l’H2O2 dans la formation des réarrangements tel que BCR/ABL observé dans les leucémies permettrait de classer les espèces réactives de l’oxygène parmi les facteurs susceptibles d’engendrer une rupture des sites fragiles.
L’analyse de l’expression de la translocation RET/PTC1 dans une lignée de fibroblastes humains a montré qu’aucune cellule n’était positive pour la translocation après irradiation confirmant ainsi la spécificité thyroïdienne de la translocation RET/PTC1. D’autres résultats ont démontré le caractère tissu-spécifique de la translocation. Ainsi, des expériences de « comet assay » ont mis en évidence que la radiosensibilité du gène RET est particulièrement augmentée dans les cellules thyroïdiennes (Volpato Beu et coll 2008). L’analyse en 3D de la structure du chromosome 10 lors de l’interphase montre un rapprochement entre RET et son partenaire CCDC6 dans la thyroïde, favorisant ainsi la fusion des deux gènes dans ce tissu (Ghandi et coll 2006). Cette proximité entre le gène RET et son partenaire de fusion est observée aussi bien dans la thyroïde d’enfants que dans celle d’adultes suggérant que d’autres mécanismes sont impliqués dans la susceptibilité des enfants à développer un cancer de la thyroïde après une exposition aux radiations ionisantes.
Une étude menée par le groupe de Fagin a rapporté une fréquence importante de réarrangement RET/PTC1 dans des cancers papillaires sporadiques chez des enfants n’ayant jamais été exposés à des radiations ionisantes thérapeutiques ou accidentelles (Nikiforov et coll, 1997). Nos résultats, en lien avec les données de la littérature suggèrent que l’H2O2 par lui-même pourrait être à l’origine du gène chimère RET/PTC1 retrouvé dans 15% des cas.
Les thyrocytes possèdent deux systèmes générateurs d’H2O2 localisés au pôle apical qui sont les NADPH oxydases DUOX1 et la DUOX2 (Dupuy et coll, 1999 ; De Deken et coll, 2000). L’expression d’une autre NADPH oxydase (NOX4) a été récemment mise en évidence dans les thyrocytes humains au niveau intracellulaire (Weyemi et
des systèmes qui le produisent, tels que les NADPH oxydases, dans la thyroïde. En effet, des données obtenues chez le rat montrent une fréquence élevée de mutations somatiques et de lésions oxydatives puriques et pyrimidiques dans la thyroïde comparativement à d’autres organes tels que le foie, la rate et le poumon (Maier et coll, 2006). Par ailleurs, les thyrocytes présentent également une fréquence relativement élevée de mutations du récepteur de la TSH résultant de lésions oxydatives (Krohn et coll 2007). À la lumière de ces observations et compte tenu du caractère radiosensible de la thyroïde il nous est apparu essentiel d’étudier l’expression et la régulation des NADPH oxydases en réponse à l’irradiation.
Un système générateur de ROS participerait-il aux effets délétères de l’irradiation ?
Les NADPH oxydases dont l’unique fonction est la production de ROS peuvent être activées très rapidement par une stimulation par des facteurs de croissance, ou des cytokines (Tolando et coll, 2000), lesquels sont produits en quantité importante en réponse à l’irradiation. Les effets des radiations ionisantes sur les NADPH oxydases restent encore mal connus. Peu de travaux dans la littérature se sont intéressés à l’activation des NOXs/DUOXs à des temps tardifs c’est à dire plusieurs jours aprés irradiation. En revanche plusieurs travaux montrent l’implication d’une NADPH oxydase aux temps précoces. Ainsi, une exposition aux rayons X induit l’expression et l’activation d’une NADPH oxydase quelques heures après dans des cellules HeLa et dans des cellules endothéliales (Liu et coll, 2008) (Collins-Underwood et coll 2008). Le diphénylène iodonium (DPI), un inhibiteur des NADPH oxydases, diminue de manière significative l’instabilité génomique détectée dans les cellules hématopoïetiques de souris (Pazhanisamy et coll, 2011). Récemment, le rôle de NOX4 dans les mécanismes moléculaires conduisant aux fibroses radioinduites a été montré : l’augmentation de l’expression de NOX4 est due à une régulation positive par le TGF# produit à l’issue de l’irradiation (Park et coll, 2010).
Bien que l’équipe ait montré une expression de NOX4 dans la thyroïde, nous n’observons pas d’effet de l’irradiation sur l’expression de son ARN messager 24 h après. On ne peut cependant pas exclure une régulation positive de cette NADPH oxydase à des temps précoces. En revanche nos travaux montrent pour la première fois une augmentation de l’expression de DUOX1 dans les jours qui suivent l’exposition aux radiations ionisantes, suggérant l’implication d’une cascade
d’évènements qui va conduire à l’activation de facteurs et de voies de signalisation responsables de l’activation tardive de la DUOX1.
L’augmentation de l’expression DUOX1 après irradiation n’est pas restreinte à la thyroïde. En effet, nous avons également observé une augmentation de son expression corrélée à une augmentation de l’activité génératrice d’H2O2 dans les fibroblastes humains plusieurs jours après irradiation (Résultats supplémentaires). Il semble donc que ce soit un mécanisme plus général. La DUOX1 peut-elle alors être considérée comme un marqueur du stress oxydatif associé à des pathologies radio-induites ? L’étude de son profil d’expression en immunohistochimie et en PCR quantitative dans des cancers radio-induits permettra de mieux répondre à cette question.
Comment l’irradiation peut-elle induire l’expression de DUOX1 ?
L’exposition à des radiations ionisantes induit de nombreuses voies de signalisation intracellulaires qui impliquent les voies de survie médiées par les récepteurs tyrosine kinase tel que l’EGFR (comme les voies ERK et PI3K/AKT), les facteurs de transcription comme la p53 ou le NF!B, les récepteurs aux chimiokines comme le CXCR4 (Chang, et coll, 2009) et également la sécrétion de cytokines comme le TGF#, le TNF$, l’IL6 et l’IL8 (Chendil, et coll 2004 ; Xia et coll , 2009). Tous ces éléments sont essentiels à la réponse inflammatoire induite par l’irradiation (Eichholtz-Wirth et coll, 2002 ; Zhou et coll, 2001).
L’analyse du profil pro-inflammatoire des transcits des cellules thyroïdiennes après une exposition aux rayonnements ionisants nous a permis de montrer une forte augmentation des cytokines IL1#, TNF$, IL13, IL6 et IL8 dans les jours qui suivent l’irradiation. L’IL1 et le TNF$ font partie des cytokines qui ont été décrites comme étant induites par l’irradiation et qui contribuent au développement des pathologies en marge des traitements radiothérapeutiques (Zimmermann et coll, 1998, Johnston et coll 1996, Liu et coll 2006).
De précédentes études ont montré que la production d’IL6 et d’IL8 est modulée par les rayonnements ionisants de manière dépendante de la dose d’irradiation dans différents types cellulaires comme les fibroblastes, les kératinocytes et les cellules épithéliales (Tabata et coll, 2006, Beetz et coll, 1997, Rodier et coll, 2009). Cette
production peut être effective quelques heures ou quelques jours après irradiation selon les types cellulaires.
Le rôle du TGF# a été largement caractérisé dans de nombreuses pathologies y compris dans celles associées aux radiations ionisantes (Branton et coll 1999, Barcellos-Hoff 1994, 1993). L’activation très précoce du TGF# par les rayonnements ionisants a été analysée in vivo sur un modèle de peau et de poumon (Martin et coll, 2000). L’augmentation précoce de l’expression de NOX4 dans les fibroblastes irradiés est régulée par le TGF#. Par conséquent, l’absence d’expression de NOX4 et du TGF# à des temps tardifs après irradiation dans les cellules thyroïdiennes est corrélée aux précédentes données de la littérature.
Puisque le profil d’expression des différentes cytokines (IL1, TNF$, IL13) coïncide avec l’augmentation de l’expression de DUOX1 observée plusieurs jours après irradiation, nous avons étudié l’implication d’une de ces cytokines dans la régulation de la NADPH oxydase DUOX1.
L’Il13 est décrite comme étant augmentée dans les fibroblastes irradiés (Lee et coll, 2010 ; Zhao et coll, 2009,). Nos résultats montrent que l’IL13 est un médiateur de l’effet de l’irradiation sur l’expression de DUOX1 dans la thyroïde. La voie classique de transduction du signal de l’IL13 est médiée par le facteur de transcription STAT6. L’IL13 en se fixant sur l’hétérodimère formé par l’IL4R$ et l’IL13R$ (Hershey et coll, 2003) induit la phosphorylation de ce facteur, lequel une fois transloqué dans le noyau, induit l’expression des gènes cibles (Palmer-Croker et coll, 1996). L’augmentation de la forme phosphorylée de STAT6 observée dans nos conditions indique une activation de la voie IL13. Il a été rapporté récemment que DUOX1, induite sous l’effet d’un traitement aux cytokines de type Th2 comme IL13 et l’IL4 dans les kératinocytes humains, contribue à l’augmentation de la phosphorylation de STAT6 à travers l’inhibition de la tyrosine phosphatase 1B (Hirakawa et coll, 2011). Par conséquent, DUOX1 est un régulateur des voies de signalisation impliquant STAT6. Aucun effet de l’inhibiteur de STAT6 sur l’expression de l’ARN messager de DUOX1 mesurée après irradiation n’a été observé dans nos conditions indiquant que STAT6 n’est pas impliqué dans la voie de l’IL13 qui régule DUOX1. Cependant, nous ne pouvons pas exclure que DUOX1 participe à l’activation de STAT6.
De manière intéressante, l’Il13 est trouvé augmenté dans de nombreux cancers et joue un rôle important dans la suppression de la réponse immunitaire anti-tumorale (Terabe et coll, 2004). Un travail récent a montré par CGH array et par immunohistochime une augmentation de l’IL13 dans les cancers papillaires de la thyroïde comparativement aux nodules bénins (Zhao et coll, 2009), suggèrant une implication de cette cytokine dans la tumorigenése thyroïdienne. Puisque nos résultats montrent que DUOX1 est augmenté après irradiation via l’IL13, il nous faudra maintenant étudier l’expression de l’IL-13 dans les cancers radioinduits, afin de confirmer le lien entre l’expression de l’IL13 et celle de DUOX1.
La DUOX1 est-elle impliquée dans la sénescence radioinduite ?
L’irradiation est à l’origine de dommages à l’ADN lesquels activent « la réponse aux dommages (DDR) » qui se caractérise par une augmentation de l’expression des protéines impliquées dans la mise en place des mécanismes de la réparation de l’ADN. La DDR implique notamment les protéines kinases ATM et ATR, la protéine kinase CHK2 et l’histone H2AX. La voie ATM/CHK2 est impliquée dans la production de cytokines inflammatoires comme l’IL6 et l’IL8 par les cellules devenues sénescentes après une forte dose d’irradiation (10 Gy) (Rodier et coll, 2009). Cette sécrétion de cytokine est associée au caractère persistant de la DDR en lien avec l’importance des dommages à l’ADN et n’est effective que plusieurs jours après l’irradiation indiquant que la DDR canonique, par elle-même, qui se met en place immédiatement après les dommages, n’est pas suffisante. Il a été montré que la voie p38MAPK est également impliquée dans la production de cytokines associées à la sénescence. Mais bien qu’étant décrite être activée par la DDR via ATM, il apparaît que dans ce cas l’activation tardive de la p38MAPK soit indépendante d’ATM et que les deux voies coopèrent de manière indépendante dans la régulation de l’expression des cytokines. En accord avec ce qui a été récemment décrit pour les cytokines IL-6 et Il-8 nous observons que la p38MAPK et ATM sont toutes deux impliquées dans l’induction de l’expression de l’IL-13 et donc dans l’expression de DUOX1. D’où vient alors l’activation tardive d’ATM et de P38 ? Plusieurs travaux ont montré le rôle des ROS dans l’activation des protéines kinases ATM et p38MAPK. Ainsi, l’H2O2 peut par lui-même activer ATM en absence de dommage à l’ADN. Dans ce cas il induit une dimérisation de la protéine ATM nécessaire à son activation via la formation de ponts dissulfure entre deux résidus cystéines (Guo et coll, 2010). La
phosphorylation de la p38MAPK peut, quand à elle, être augmentée en réponse à un stress oxydant via la libération de la MAPKKK, ASK1 (Saitoh et coll, 1998). Il est donc envisageable que les ROS produites par DUOX1 et régulées en amont par ATM et la p38MAPK participent elles-mêmes à l’activation de ces kinases par un mécanisme redox et, dans le cas d’ATM, concourent au maintien de la DDR. Ce rétro-contrôle des ROS dans le maintien de la DDR nécessaire à l’établissement du processus de sénescence a été décrit récemment par Passos et collaborateurs. Cependant dans ce cas, les ROS contribuent de manière aléatoire aux dommages de l’ADN. La phosphorylation de la serine 19 de CHK2 à des temps tardifs après irradiation, décrite préalablement comme étant observée uniquement après la formation de cassures double-brin à l’ADN, et la diminution de la phosphorylation de l’histone H2AX observée après inactivation de DUOX1, suggèrent que les ROS participent à l’activation de la DDR, non pas par un mécanisme redox, mais en générant des dommages à l’ADN.
Des travaux publiés récemment par l’équipe ont montré dans un modèle de lignée thyroïdienne que H-Ras oncogénique induit la NADPH oxydase NOX4 qui, en produisant des ROS, participe aux dommages à l’ADN, lesquels contribuent à l’établissement du processus de sénescence . Puisque NOX4 peut être induit de manière précoce en réponse à l’irradiation, Il est donc envisageable que NOX4 soit impliquée dans l’activation de la DDR, conduisant à l’expression de DUOX1, laquelle contribuerait à son tour au maintien de la DDR et donc au phénomène de sénescence.
Le rôle de la p38MAPK dans la production des cytokines telles que l’IL-6 et l’IL-8 lors de la sénescence est médié par l’activation du facteur de transcription NF!B (Freund et coll, 2011). La voie ATM agit en synergie avec celle de p38MAPK dans cette activation. Il a été décrit que l’H2O2 augmente la sécrétion d’IL6 via l’activation de NF&B (Kosmidou et coll, 2002). Par conséquent, l’H2O2 produit par DUOX1 peut participer à la régulation de l’expression des cytokines dépendantes de NF&B. Des résultats préliminaires de l’équipe montrent que l’inactivation de la DUOX1 par des ARNs interférents diminue de manière significative la production d’IL6 mesurée 4 jours après irradiation. DUOX1 pourrait non seulement participer au maintien de la DDR et à l’activation de la p38MAPK mais être également un activateur de NF !B, et donc de la production de cytokines. Il sera donc particulièrement intéressant
d’analyser et de comparer le profil d’expression des différentes cytokines/chimiokines dans les cellules thyroïdiennes dont l’expression du gène DUOX1 aura été invalidé ou non par ARN interférence. L’analyse du cycle cellulaire dans les cellules invalidées pour DUOX1 permettra de mieux définir le rôle de cette protéine dans le processus de sénescence radio-induite.
Existe-t-il d’autres voies d’activation de la DUOX1 après irradiation ?
L’activation de nombreux facteurs de transcription tels que NF!B, p53, AP-1 et Sp-1, a été observée dans différents types cellulaires exposées à des doses d’irradiation allant de 0,2 à 20 Gy (Lu et coll, 1993, Brach et coll, 1993, Yang et coll, 2000). Le promoteur minimal de la DUOX1 comportant plusieurs sites Sp-1, l’étude du rôle de ce facteur de transcription dans l’activation de l’expression de DUOX1 a été entreprise.
Nos résultats préliminaires montrent que l’utilisation d’un inhibiteur de Sp-1 (la mithramycine) engendre une diminution de l’expression du transcrit de DUOX1 après irradiation. De manière intéressante, Sp-1 possède des sites de phosphorylation par la kinase ATM. L’activation de ces sites en réponse aux dommages à l’ADN a été montrée dans les minutes qui suivent l’irradiation (Iwahori et coll, 2008). Cependant, il n’a pas été montré que Sp-1 ainsi phosphorylé soit actif et contrôle la transcription