Ces résultats placent la SphK1 comme régulateur central des facteurs HIF-a. Or la S1P produite par la SphK1 joue un rôle clef dans la majorité des mécanismes contrôlés par cette protéine et cela notamment par l’activation des récepteurs à la S1P. La suite de ce travail consistera ainsi à étudier le rôle de la S1P extracellulaire dans les mécanismes de régulation des facteurs HIF-a par la SphK1.
Rôle de la S1P extracellulaire dans la régulation des facteurs HIFs :
Nous avons donc étudié si la S1P extracellulaire pouvait être impliquée dans la régulation des facteurs HIF-a dans nos modèles cellulaires. Ainsi des résultats préliminaires obtenus au sein de notre équipe semblent également confirmer le rôle de la S1P extracellulaire dans la régulation des facteurs HIF-a. En effet, dans un premier temps nous avons étudié l’effet de la déplétion de la S1P extracellulaire sur le taux de HIF-1a dans différentes lignées cellulaires : PC3 (cancer prostatique), U87 (glioblastome) et A549 (cancer pulmonaire). Pour cela, nous avons utilisé un outil original : un anticorps dirigé contre la S1P. Cet anticorps anti-S1P mis au point par l’équipe de Roger Sabbidini (Visentin et al, 2006) est capable de bloquer l’action extracellulaire de la S1P en agissant comme une « éponge » vis-à-vis de ce sphingolipide. Nous avons ainsi montré que l’utilisation de cet anticorps bloquant la S1P extracellulaire provoque une diminution du taux de HIF-1α dans nos différents modèles cellulaires, diminution dépendante de la concentration d’anticorps utilisée (figure 1A). De plus, cet anticorps est à même de diminuer l’activité transcriptionnelle des facteurs HIFs. En effet, comme montré dans la figure 1B, le traitement des cellules PC3 et A549 avec l’anticorps anti-S1P a pour conséquence une diminution de l’expression du système de gènes rapporteurs traduisant une diminution de l’ordre de 35 % de l’activité transcriptionnelle des facteurs HIFs.
Figure 1 : l’utilisation d’un anticorps anti-S1P entraîne une diminution du taux de HIF-1a et de son activité transcriptionnelle:
Les lignées PC3, U87 et A549 ont été traitées avec des concentrations croissantes d’anticorps. L’expression de HIF-1α a ensuite été analysée par western-blot. Les lignées PC3 et A549 ont été traitées avec 50 µg/ml d’anticorps ou 5 µM de SKi comme contrôle puis incubées pendant 18 heures en hypoxie (0,1 % d’oxygène). L’activité transcriptionnelle de HIF a ensuite été mesurée en utilisant un système de gène rapporteur HRE- luciférase.
A
Rôle des récepteurs la S1P1 et S1P3 dans la régulation des facteurs HIFs :
Nous avons vu que la S1P extracellulaire peut agir via 5 récepteurs, S1P1-5, une partie du
travail consistera donc à identifier les récepteurs impliqués dans les mécanismes de régulation des facteurs HIFs. Afin de déterminer quels sont les récepteurs impliqués, nous
avons dans un premier temps utilisé un composé antagoniste des récepteurs S1P1 et
S1P3, le VPC23019. Les premiers résultats obtenus avec cet antagoniste montrent que
l’un ou les deux récepteurs seraient impliqués dans cette régulation. En effet, le VPC23019 est capable de provoquer une diminution de l’expression des facteurs HIFs (figure 2A) ainsi que de leur activité transcriptionnelle (40 % pour la lignée PC3 et 60 % pour la lignée A549) (figure 2B) et cela dans plusieurs lignées cellulaires différentes.
Figure 2 : l’utilisation d’un antagoniste des récepteurs S1P1 et S1P3 entraîne une diminution du taux
de HIF-1a et de son activité transcriptionnelle:
Les lignées PC3, U87 et A549 ont été traitées avec des concentrations croissantes de VPC23019. L’expression de HIF-1α a ensuite été analysée par western-blot. Les lignées PC3 et A549 ont été traitées avec 2 µM de VPC23019 ou 5 µM de SKi comme contrôle puis incubées pendant 18 heures en hypoxie (0,1 % d’oxygène). L’activité transcriptionnelle de HIF a ensuite été mesurée en utilisant un système de gène rapporteur HRE-luciférase.
A
Rôle des récepteurs la S1P extracellulaire dans la régulation du facteur HIF-2a dans les lignées de RCC :
Dans ce travail, nous avons montré que la SphK1 était capable de réguler le taux des facteurs HIF-1a et HIF-2a. Néanmoins, cette régulation semble impliquer deux mécanismes différents : une régulation de la stabilité pour le facteur HIF-1a (Ader et al, 2008b) et une régulation de la traduction pour le facteur HIF-2a. Nous avons donc voulu étudier l’implication de la S1P extracellulaire dans la régulation de HIF-2a. Pour cela, nous avons étudié l’effet de l’anticorps anti-S1P et du VPC23019 sur l’activité transcriptionnelle de HIF-2 dans la lignée 786-O n’exprimant pas la protéine HIF-1a. Nous avons ainsi pu observer que à la fois l’anticorps anti-S1P et le VPC23019 étaient capables d’induire une diminution d’environ 40 % de l’expression du système de gènes rapporteurs dans la lignée 786-O (figure 3) laissant supposer que la S1P extracellulaire est également impliquée
dans la régulation de l’expression du facteur HIF-2a via les récepteurs S1P1 et S1P3.
L’ensemble de ces résultats préliminaires portant sur le rôle de la S1P extracellulaire dans laissent supposer un rôle clef de ce sphingolipide dans les mécanismes de régulation des
facteurs HIFs par la SphK1. De plus, il semblerait que les récepteurs S1P1 et S1P3 soient
Figure 3 : l’utilisation de l’anticorps anti-S1P ou d’un antagoniste des récepteurs S1P1 et S1P3 entraîne une diminution de l’activité transcriptionnelle de HIF-2:
Les cellules de la lignée 786-O ont été traitées avec 50 µg/ml d’anticorps, avec 2 µM de VPC23019 ou 5 µM de SKi comme contrôle puis incubées pendant 18 heures en hypoxie (0,1 % d’oxygène). L’activité transcriptionnelle de HIF-2 a ensuite été mesurée en utilisant un système de gène rapporteur HRE- luciférase.