1 - Derniers travaux de l’équipe sur la ségrégation de la région
Terminale.
Récemment, nous avons montré que la région Terminale est organisée en périphérie du nucléoïde (Meile 2011, Publication en annexe I). La région Terminale possède une localisation périphérique qui ne dépend pas d’une étape particulière du cycle cellulaire. La région Terminale est située préférentiellement en périphérie au nouveau pôle et au centre de la cellule. En début de cycle cellulaire, la région Terminale est située au nouveau pôle de la cellule et migre ensuite au centre de la cellule pour y être répliquée. La migration de la région Terminale au centre de la cellule se fait progressivement. L’ordre de migration de ces loci au centre de la cellule se fait selon l’ordre de réplication (sur la carte génétique), en premier les plus proches des Macro Domaines Left et Right puis les plus éloignés (Espeli 2012). Une fois le divisome formé, la région Terminale interagit via MatP, avec ZapB qui est une protéine associée au divisome, et qui maintient cette région en périphérie au centre de la cellule.
Nous avons récemment montré que l’activité de la translocase à ADN, FtsK, est réduite à une région autour du site dif (Deghorain 2011, Publication annexe II). Le taux de recombinaison d’une cassette dif-lacI-dif (dans une souche lacI-, dif- et xerC- portant un plasmide produisant XerC : pFC241), insérée à différentes positions de la région Terminale, a été mesuré (Figure 28AB). Ce crible génétique permet de mesurer le taux de recombinaison induit par FtsK. L’activité de FtsK est restreinte à une zone de 400kb autour du site dif et est nommée FHAR (FtsK High Activity Region). L’activité de FtsK dans cette région dépend de sa capacité à transloquer l’ADN et non de l’orientation de l’activité de translocation. En effet, quand FtsK ne peut plus reconnaître les KOPS (points rouges, Figure 28C), le taux de recombinaison est le même en dehors et dans dans la FHAR. Un changement de la terminaison de la réplication par l’ajout d’un nouveau terminateur de réplication, qui réduit la fenêtre de la fin de réplication à 50kb en dehors de la FHAR (au lieu de 300kb environ dans la FHAR), ne change pas l’activité de FtsK dans la FHAR. L’activité de FtsK est donc régulée par des acteurs post-réplicatifs. Nous avons aussi montré qu’il existe un ordre de ségrégation particulier dans la région Terminale qui sépare la ségrégation des loci dans, et en dehors de la FHAR. Les loci de la FHAR semblent être ségrégés dans la même fenêtre de temps en toute fin du cycle cellulaire.
2 - Objectif de Thèse
La dynamique du chromosome d’Escherichia coli est différente des autres bactéries étudiées comme B.subtilis, V.cholerae, P.aeruginosa ou C.crescentus : E. coli ne dispose pas de système Par et la compréhension des mécanismes de ségrégation du chromosome est encore inconnue à ce jour. La seule translocase à ADN présente chez E. coli, nommée FtsK, n’est essentielle pour la survie de la cellule, que pour l’assemblage du septum. FtsK n’a été caractérisé jusqu’à présent, que pour la ségrégation des chromosomes dimériques.
Des travaux récents montrent que la ségrégation des chromosomes s’effectue via des forces qui, soit s’accumulent dans des zones précises du nucléoïde et qui mènent à la ségrégation de grands fragments du nucléoïde lorsque ces forces sont relâchées (Fisher
2013), soit par la perte progressive de forces qui sont présentes au sein des domaines
topologiques (Jun and Wright 2010). Les régions Origine et Terminale disposent d’une dynamique plus complexe que les autres régions du chromosome. La région Origine a longtemps été supposée comme étant la région qui donne la force de ségrégation au reste du chromosome sur la supposition de la présence d’une ou plusieurs séquences centromérique de type parS dans cette région. Une séquence centromérique nommée migS découverte dans la région Origine, ne permet que de localiser spécifiquement les régions Origine aux positions ¼ et ¾ dans la cellule. Cette localisation spécifique de la région Origine ne donne pas les forces nécessaires à la ségrégation du reste du chromosome.
La région Terminale est la dernière à être répliquée puisque les sites de terminaison de la réplication se trouvent dans cette région. Il est supposé que la symétrie ori/dif permet à la réplication de se terminer préférentiellement autour du site dif par fusion/collision des fourches de réplication (Higgins 2007). De plus, c’est dans la région Terminale et au niveau du site dif que sont résolus les dimères de chromosomes. La région Terminale est la seule qui possède une organisation condensée dépendante d’une unique protéine, MatP. Elle est aussi la seule qui possède une localisation post-réplicative étendue au centre de la cellule dépendante de l’interaction avec un acteur du divisome, ZapB. C’est au niveau de la région Terminale que s’accumuleraient les caténanes formés en fin de réplication, ce qui pourrait retarder la ségrégation de cette région.
Toutes ces propriétés, montrent que la région Terminale est vraiment différente des autres régions du chromosome. Si la ségrégation des autres régions du chromosome est ordonnée et suit l’ordre des gènes sur la carte génétique hormis certaines régions comme les SNAPs (Joshi 2011), nous ne savons pas comment est ségrégée la région Terminale.
Au vu de la complexité des mécanismes ayant lieu dans la région Terminale en fin du cycle cellulaire, la ségrégation de cette région doit être dépendante de points de contrôles particuliers qui sont à définir puisque les dernières analyses de la ségrégation de plusieurs loci de cette région sont imprécises (Li 2003).
Dans ce contexte, l’objectif principal de ma thèse était de caractériser le profil de ségrégation de la région Terminale et les acteurs intervenant dans cette ségrégation.
Mes objectifs étaient de répondre à ces questions :
(i) Quel est le rôle de FtsK sur les chromosomes monomériques ? FtsK ne peut pas différencier un monomère d’un dimère lorsqu’elle transloque l’ADN puisque les deux disposent de KOPS. Or, l’activité de FtsK n’a été caractérisée que sur des dimères.
(ii) Comment s’effectue la ségrégation de la FHAR avec toutes les contraintes topologiques présentes ? On sait que la ségrégation de tout le chromosome est ordonnée et progressive et suit l’ordre de réplication des loci. Comment est ségrégée la région Terminale si les contraintes topologiques y sont plus importantes et si la localisation de cette région est différente du reste du chromosome ?
(iii) On sait qu’un changement de la fin de réplication du chromosome, n’affecte pas le timing de ségrégation des loci dans la FHAR (Deghorain 2011). Quels sont les acteurs post- réplicatifs responsables de la ségrégation de cette région ? Est-ce que FtsK permet la ségrégation de cette région ou bien d’autres acteurs interviennent ?
(iv) Quelle est la chorégraphie de la région Terminale au cours du cycle ? L’objectif posé par cette question est d’éclairer le rôle du positionnement de la région Terminale dans la dynamique de tout le nucléoïde en étudiant la dynamique des principaux Macro Domaines du chromosome dans des contextes où l’occlusion par le nucléoïde n’est plus présente (slmA-) ou quand la région Terminale n’est plus organisée (matP-).