Tout d’abord, nous avons montré que p400 est important pour la prise en charge des DSB puisque l’absence de p400 induit une hypersensibilité aux agents endommageant l’ADN comme les irradiations ionisantes, la bléomycine et la mitomycine C. Par la suite, nous avons analysé, par immunofluorescence, l’apparition et la disparition des foyers γH2AX en réponse aux radiations ionisantes. L’inhibition de p400 par des siRNA induit une augmentation de ces foyers aussi bien lors de leur mise en place, caractérisant la signalisation des DSB, que lors de leur disparition,
caractérisant la réparation des DSB. Notons que la déplétion de p400 induit à elle seule une augmentation des foyers γH2AX au sein des cellules. L’ensemble de ces données suggère un rôle inhibiteur de p400 sur la signalisation des dommages. Cependant, la disparition des foyers γH2AX est plus lente en absence de p400 ce qui est aussi en faveur d’un rôle de p400 dans la réparation des DSB. Néanmoins, ces résultats pourraient aussi être totalement expliqués par un rôle de p400 dans l’éviction de γH2AX de la chromatine comme il a été montré chez la drosophile (Kusch, 2004). Pour répondre à cette question nous avons alors analysé l’activation d’ATM après irradiation, un autre composant de la voie de réponse aux dommages. L’activation d’ATM se caractérise par la formation de foyers phospho-ATM visualisables par immunofluorescence. Des résultats similaires à ceux de γH2AX ont été observés. Bien qu’ils suggèrent un rôle de p400 dans l’inhibition de la signalisation, ils sont aussi en faveur de son rôle dans la réparation des DSB. Néanmoins, ils n’excluent pas un rôle supplémentaire de p400 dans l’échange de γH2AX autour des DSB.
Pour tester directement si p400 joue un rôle dans la réparation de l’ADN, nous avons analysé la cinétique de disparition des cassures de l’ADN après exposition aux radiations ionisantes. Pour cela, nous avons réalisé des tests comet avec des fibroblastes embryonnaires de souris dont le gène p400 a été partiellement délété et des lignées cellulaires U2OS déplétées pour p400 à l’aide siRNA. Nous avons pu observer que ces cellules présentent un défaut de réparation des cassures de l’ADN. Cela démontre que même si p400 participe à la signalisation des DSB, il joue aussi un rôle dans leur réparation.
Par la suite, nous avons pu montrer que p400 participe à la réparation par homologie de séquence suggérant un rôle de p400 dans la recombinaison homologue. Pour cela, nous avons utilisé une lignée cellulaire qui présente, intégré dans son génome, un substrat qui nous permet de quantifier les événements réparés par homologie de séquence. Afin de déterminer à quelle étape de la recombinaison homologue p400 pourrait participer, nous avons examiné la résection de l’ADN, une des premières étapes de la HR. Celle-ci génère des extrémités simples brins rapidement recouvertes par la protéine RPA qui est alors phosphorylée. Nous avons donc analysé l’apparition des foyers phospho-RPA après exposition aux radiations ionisantes. La déplétion de p400 induit une légère augmentation de ces foyers. Nous avons aussi testé l’implication de p400 dans la signalisation des dommages par ubiquitination à la suite de l’exposition aux radiations ionisantes. Pour cela, nous avons analysé la formation des foyers de protéines ubiquitinylées, des foyers BRCA1 et des foyers 53BP1. L’inhibition de l’expression de p400 induit une légère augmentation des foyers d’ubiquitine et des foyers 53BP1. Cependant, elle induit une diminution de la formation
des foyers BRCA1. Ces résultats suggèrent que la résection et la signalisation des DSB ne sont pas affectées par la déplétion de p400. Cependant, p400 doit jouer un rôle dans le recrutement de BRCA1 via la régulation d’une autre voie que celle de l’ubiquitination. L’étape qui suit la résection est caractérisée par le chargement de Rad51 sur les extrémités simples brins afin de permettre l’étape d’envahissement du brin. Nous avons donc testé l’influence de p400 sur le recrutement de Rad51 par immunofluorescence en réponse aux radiations ionisantes ou par immunoprécipitation de chromatine (ChIP) autour de DSB. En effet, pour réaliser ces expériences de ChIP, nous disposons d’une lignée cellulaire au sein de laquelle nous pouvons induire des DSB au niveau de séquences d’ADN génomique spécifiques et connues (voir papier). Nous avons pu montrer que la déplétion de p400 induisait un défaut de formation des foyers Rad51 et un défaut de recrutement de celui-ci autour des DSB. Tous ces résultats suggèrent que p400 ne participe à la HR qu’à partir du chargement de Rad51. Le défaut de recrutement de BRCA1 serait alors expliqué puisqu’il est aussi connu pour former un complexe avec Rad51 et BRCA2. De plus, nous pouvons remarquer que toutes les étapes qui se déroulent avant le chargement de Rad51 sont légèrement suractivées en l’absence de p400. Cela est en accord un défaut de réparation ne se produisant qu’après l’étape d’invasion de brin.
La HR se réalise majoritairement pendant les phases S et G2 du cycle cellulaire. Nous avons donc examiné à quelle étape du cycle cellulaire p400 joue un rôle dans la réparation des DSB. Après un tri des cellules en phase G1, S et G2/M grâce à la quantification de la fluorescence émise par le Hoechst, nous avons tout d’abord examiné l’apparition et la disparition des foyers γH2AX. Alors que les foyers γH2AX sont mis en place lors de toutes les phases du cycle cellulaire, l’absence de p400 induit un maintien des foyers γH2AX beaucoup plus important dans les phases S et G2/M ce qui est en accord avec son rôle dans la HR. Nous avons aussi analysé la mise en place des foyers Rad51. Nous avons observé qu’ils sont induits seulement lors des phases S et G2 ce qui valide notre méthode d’analyse. De plus, la déplétion de p400 conduit à un défaut de formation des foyers Rad51 aussi bien en S qu’en G2/M. Nous pouvons donc en conclure que p400 participe à la réparation des DSB par HR que les dommages soient produits lors de la réplication ou lors de la phase de préparation à la mitose.
Enfin, pour aller plus loin dans l’étude mécanistique de p400 dans la HR, nous avons montré, par co-immunoprécipitation, que p400 est présent en complexe avec Rad51 avant et après l’induction de dommages à l’ADN. De plus, ils interagissent probablement directement puisque ces données ont été confirmées par la technique de FRET-FLIM. Nous avons aussi pu montrer que
p400 participe à la recombinaison homologue via son activité ATP-ase qui est cruciale pour sa fonction de remodeleur de la chromatine. Nous avons dons testé si Rad51 et p400 jouaient un rôle dans le remodelage de la chromatine autour des DSB en regardant par ChIP l’enrichissement en H3 autour de DSB. Nous avons observé une déplétion de l’histone H3 autour des DSB caractérisant la relaxation de la chromatine. Celle-ci est partiellement réversée après l’inhibition de l’expression de p400 ou Rad51 ce qui suggère que tous deux participent au remodelage de la chromatine autour des DSB probablement au sein de leur complexe.