2.1. Mesure de la densité optique
Les résultats sont présentés dans les figures 1 et 2 pour deux souches bactériennes (65A et 88C). Par rapport au PBS seul, la DO varie peu en présence ou non des bactéries. En revanche l’ajout de liposomes dans le PBS fait logiquement augmenter la DO. On constate qu’après 1H ou 14H, la DO semble être plus importante en présence des liposomes et des bactéries, et ce de façon proportionnelle à la quantité de PE présente dans les liposomes. L’augmentation de DO observée avec la formulation PLB7 ne contenant pas de DMPE, notamment avec la souche 65A, peut provenir, soit de la simple addition des opacités des liposomes et des bactéries, soit d’une agglutination liée à la présence de cholestérol (cf chapitre V).
D’autres tests ont été faits avec d’autres souches bactériennes, et d’autres temps d’incubation, et les mêmes profils de réponses sont systématiquement obtenus. Il semblerait donc qu’il y ait une interaction bactérie – liposomes porteurs de phosphatidylethanolamine.
Fig.1: Mesure de la DO après 1heure pour 2 souches bactériennes : 65A et 88C en présence ou non de liposomes.
Fig.2: Mesure de la DO après 14 heures pour 2 souches bactériennes : 65A et 88C en présence ou non de liposomes.
Absorbance à T=1H PBS PBS+PLB7 PBS+PLB8 PBS+PLB9 PBS+Bactérie Bactérie+PLB8 Bactérie+PLB9 Bactérie+PLB7 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 A b s o rb a n c e 6 3 0 n m 65A 88C Absorbance à T=14H PBS PBS+PLB7 PBS+PLB8 PBS+PLB9 PBS+Bactérie Bactérie+PLB7 Bactérie+PLB8 Bactérie+PLB9 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 A b s o rb a n c e 6 3 0 n m 65A 88C
2.2. Observation au microscope
Les résultats sont présentés dans le tableau I. Là encore une tendance semble se dégager, sans pour autant être très nette, mais surtout, ces observations ne sont pas quantifiables, donc difficiles à comparer. Les bactéries dans le tampon ont parfois tendance à se coller les unes aux autres, mais ceci est variable en fonction des souches utilisées. L’ajout de la formulation PLB7 ne semble pas apporter de grands changements quant à une éventuelle agrégation des bactéries entre elles. En revanche, il semblerait que la formulation PLB8 mais surtout PLB9 entraîne la formation d’agrégats au sein des bactéries.
Tableau I : Agrégation des bactéries en présence des différentes formulations.
Bactérie + PBS Bactérie + PLB7 Bactérie + PLB8 Bactérie + PLB9
Souche 88C - +/- ++ ++
Souche 98A +/- +/- + ++
Souche 99A2 + + + +(+)
Souche 149C +/- +/- + +
Légende : - signifie qu’il n’y a pas d’agrégats et que les bactéries sont séparées les unes des autres. +/- signifie qu’il n’y a pas d’agrégats à proprement parler, mais que les bactéries semblent plus facilement se coller. + signifie qu’il y a des agrégats. ++ signifie qu’il y a de nombreux agrégats.
L’interprétation reste purement subjective et demeure donc difficile. De plus l’observation ne se fait que sur une goutte et ne reflète pas forcément ce qui se passe dans le puits. L’étape de pipetage peut également biaiser les résultats en cassant les éventuels agrégats qui se seraient formés dans les puits.
Toutefois, l’ensemble de ces résultats sur l’interaction entre des liposomes porteurs de groupements phosphatidyléthanolamine et H. pylori semble confirmer que cette dernière est possible. Ces résultats confortent donc l’hypothèse formulée dans la dernière partie de ce travail, selon laquelle la faible interaction entre la bactérie et des vésicules constituées d’epikuron serait liée à la charge de surface des liposomes ainsi formulés.
Références bibliographiques :
[1] C. Lingwood, M. Huesca, A. Kuksis, The glycerolipid receptor for Helicobacter pylori (and exoenzyme S) is phosphatidylethanolamine, Infect. Immun. 60 (6) (1992) 2470-2474.
[2] C.A. Lingwood, H. pylori adhesins and receptors, in: S. Goodwin, B.W. Worsley (Eds.), Helicobacter Pylori: Biology and Clinical Practice, CRC Press, Inc, Boca Raton, 1993, pp. 209-222.
[3] B.D. Gold, M. Huesca, P.M. Sherman, C.A. Lingwood, Helicobacter mustelae and Helicobacter pylori bind to common lipid receptors in vitro, Infect. Immun. 61 (6) (1993) 2632-2638.
[4] M. Huesca, S. Borgia, P. Hoffman, C.A. Lingwood, Acidic pH changes receptor binding specificity of Helicobacter pylori: a binary adhesion model in which surface heat shock (stress) proteins mediate sulfatide recognition in gastric colonization, Infect. Immun. 64 (7) (1996) 2643-2648.
[5] D. Barnett Foster, D. Philpott, M. Abul-Milh, M. Huesca, P.M. Sherman, C.A. Lingwood, Phosphatidylethanolamine recognition promotes enteropathogenic E. coli and enterohemorrhagic E. coli host cell attachment, Microb. Pathog. 27 (5) (1999) 289-301.
[6] C. Khursigara, M. Abul-Milh, B. Lau, J.A. Giron, C.A. Lingwood, D.E. Foster, Enteropathogenic Escherichia coli virulence factor bundle-forming pilus has a binding specificity for phosphatidylethanolamine, Infect. Immun. 69 (11) (2001) 6573-6579.
[7] M.M. Bitzan, B.D. Gold, D.J. Philpott, M. Huesca, P.M. Sherman, H. Karch, R. Lissner, C.A. Lingwood, M.A. Karmali, Inhibition of Helicobacter pylori and Helicobacter mustelae binding to lipid receptors by bovine colostrum, J. Infect. Dis. 177 (4) (1998) 955-961.
[8] J. Busse, E. Hartmann, C.A. Lingwood, Receptor affinity purification of a lipid-binding adhesin from Haemophilus influenzae, J. Infect. Dis. 175 (1) (1997) 77-83.
[9] H.C. Krivan, B. Nilsson, C.A. Lingwood, H. Ryu, Chlamydia trachomatis and Chlamydia pneumoniae bind specifically to phosphatidylethanolamine in HeLa cells and to GalNAc beta 1-4Gal beta 1-4GLC sequences-found in asialo-GM1 and asial-GM2, Biochem. Biophys. Res. Commun. 175 (3) (1991) 1082-1089.
[10] F.A. Sylvester, D. Philpott, B. Gold, A. Lastovica, J.F. Forstner, Adherence to lipids and intestinal mucin by a recently recognized human pathogen, Campylobacter upsaliensis, Infect. Immun. 64 (10) (1996) 4060-4066.
[11] T.P.W. Mc Mullen, R.N. Mc Elhaney, New aspects of the interaction of cholesterol with dipalmitoylphosphatidylcholine bilayers as revealed by high-sensitivity differential scanning calorimetry., Biochim. Biophys. Acta 1234 (1995) 90-98.
[12] H. Ohvo-Rekila, B. Ramstedt, P. Leppimaki, J. Peter Slotte, Cholesterol interactions with phospholipids in membranes, Prog. Lipid Res. 41 (1) (2002) 66-97.
[13] P.L. Bardonnet, V. Faivre, F. Pirot, P. Boullanger, F. Falson, Cholesteryl oligoethyleneglycol glycosides: Fluidizing effect of their embedment into phospholipid bilayers, Biochem. Biophys. Res. Commun. 329 (4) (2005) 1186-1192.
[14] C. Trampenau, K.D. Müller, Affinity of Helicobacter pylori to cholesterol and other steroids., Microbes and Infection 5 (2003) 13-17.
[15] A.D. Bangham, M.M. Standish, J.C. Watkins, Diffusion of univalent ion across the lamellae of swollen phospholipids, J.Mol.Biol. 13 (1965) 238-252.
[16] J. Angstrom, S. Teneberg, M.A. Milh, T. Larsson, I. Leonardsson, B.M. Olsson, M.O. Halvarsson, D. Danielsson, I. Naslund, A. Ljungh, T. Wadstrom, K.A. Karlsson, The lactosylceramide binding specificity of Helicobacter pylori, Glycobiology 8 (4) (1998) 297-309.
[17] D. Yang, Q. Chen, D.M. Hoover, P. Staley, K.D. Tucker, J. Lubkowski, J.J. Oppenheim, Many chemokines including CCL20/MIP-3alpha display antimicrobial activity, J. Leukoc. Biol. 74 (3) (2003) 448-455.