Résultats et Discussion

Après l’injection i.v. de la Ce6 libre ou des G4.5-Ce6-PEG dans la veine caudale,

leur distribution au cours du temps a été monitorée in vivo par un système d’imagerie

de fluorescence (FIG. 4.1 et 4.2, respectivement).

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FIG. 4.1 Imagerie de fluorescence de souris « nude » xénogreffée avec des cellules FaDu,

injectée en i.v. avec une solution de Chlorine e6 (2,5 mg/kg).

Le cercle rouge et la fléche noire indique respectivement l’emplacement de la tumeur et du foie

(n = 5).

Dès 1 h après l’injection intraveineuse de la Ce6 libre, un fort signal de fluorescence

est détecté dans le foie (indiqué par une fléche noire), puis ce signal est maintenu dans

l’ensemble du corps jusqu’à 4 h post injection (FIG. 4.1). La Ce6 libre ne présente qu’une

faible accumulation tumorale préferentielle (représenté par un cercle rouge) comparée à

l’ensemble du corps à 4 h post injection.

Ces résultats sont en accords avec la littérature qui ont démontré de la même façon

une accumulation rapide dans les tissus hépatiques et une spécificité limitée pour les

tissus tumoraux de la Ce6 libre suite à son injection i.v. [56].

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FIG. 4.2 Imagerie de fluorescence de souris « nude » xénogreffée avec des cellules FaDu,

injectée avec une solution de G4.5-Ce6-PEG (Ce6 = 2,5 mg/kg).

Le cercle rouge indique l’emplacement de la tumeur (n = 5).

Le suivie par fluorescence de la biodistribution des G4.5-Ce6-PEG s’est avéré être

impossible (FIG. 4.2). En effet, à la suite de l’injection de la G4.5-Ce6-PEG seul un très

faible signal de fluorescence a été détecté au niveau du foie à partir de 4 h jusqu’à 8 h

post injection. Le foie étant un organe d’accumulation préférentielle des NPs, la forte

concentration hépatique des G4.5-Ce6-PEG explique le signal observé par imagerie de

fluorescence (FIG. 4.2). L’absence de fluorescence in vivo des G4.5-Ce6-PEG peut être

expliquée par leur faible intensité fluorescence dans un environnement biologique, comme

le présente les spectres de fluorescence réalisés dans du milieu de culture supplémenté

avec 9 % de sérum de veau fœtaux (FIG. 4.3). En effet, le greffage de la Ce6 en périphérie

des dendrimères G4.5 se traduit par une diminution d’environ 13 fois de son intensité de

fluorescence dans le RPMI 9 % SVF. Par ailleur, une faible fluorescence in vivo laisse

généralement présager une efficacité PDT limitée de ces NPs.

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FIG. 4.3 Spectres de fluorescence de la Ce6 (noir) et des G4.5-Ce6-PEG (rouge) dans du

milieu de culture RPMI supplémenté avec 9 % de sérum de veau fœtaux.

4.3 Conclusion

Les dendrimères PAMAM de génération 4.5 se sont présentés in vitro comme de bons

vecteurs de la Ce6, en potentialisant son internalisation cellulaire via un mécanisme

d’endocytose. Cette accumulation intracellulaire accrue des NPs a permis d’accroitre

l’efficacité PDT de la Ce6. Néanmoins, l’éfficacité des NPs par molécule de Ce6

internalisé est limitée, par sa localisation lysosomal et par son faible rendement quantique

en oxygène singulet.

De plus, l’étude in vivo des G4.5-Ce6-PEG par imagerie de fluorescence c’est révélée

impossible du faite de leur faible potentiel fluorescent en milieu biologique. Une seconde

étude de biodistribution par exérèse des organes, extraction chimique et quantification

par spectrofluorimètrie des NPs est envisageable. Néanmoins, le suivie d’un traitement

PDT par fluorescence sera impossible avec les G4.5-Ce6-PEG. De plus un faible

rendement quantique de fluorescence en milieu biologique laisse présager un faible

rendement quantique d’oxygène singulet et ainsi un effet PDT limité des G4.5-Ce6-PEG.

Pour pallier ces problèmes, des nouvelles NPs permettant un relarguage contrôlé de

la Ce6 ont été synthétisées par le Pr. Scheinder. Elles se composent d’un dendrimère

PAMAM fonctionalisé via une liaison ester avec la Ce6. Lorsque la Ce6 est liée en

périphérie du dendrimère, la NP serait inactive et devrait présenter un faible rendement

quantique d’oxygène singulet en milieu biologique. Par la suite en présence d’estérase, le

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lien ester reliant la Ce6 aux dendrimères sera clivé libérant ainsi la Ce6. La Ce6 libre

retrouvera ses propriétés photophysiques initiales avec notamment un rendement

quantique d’oxygène singulet restauré.

La composition, la caractérisation ainsi que l’étude préliminaire des nouvelles NPs

sont recensées dans le chapitre suivant.

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5

5 Nanoparticules clivables à base de

dendrimère PAMAM et de Chlorine e6

5.1 Introduction

A ce jour, les nanoparticules (NP) à libération contrôlée ont suscité l’intérêt de

nombreuses équipes. La libération peut être le résultat de stimuli extérieurs comme le

pH ou la température, mais peut aussi résulter d’un clivage enzymatique du lien reliant

le principe actif au vecteur. Le greffage des molécules actives en périphérie des

dendrimères peut être réalisé avec des liaisons bioclivables, comme des liens ester clivables

par des estérases [244] ou des peptides qui sont spécifiquement reconnu par des enzymes

surexprimées dans les cancers comme les métaloprotéases matricielles (MMP)[245].

Récemment, le paclitaxel (PTX) a été conjugué à des dendrimères PAMAM de

génération 4 via un lien peptidique clivable par les Cathepsin B, enzyme lysosomale

surexprimées dans les cancers du sein [246]. Les dendrimères-PTX ont démontré sur un

modèle de souris xenogreffé une réduction tumorale remarquable comparé à la PTX libre.

Les souris traitées avec les dendrimères-PTX présentent un volume tumoral 48% et 34%

inférieur aux souris traitées par la PTX libre, 2 et 3 semaines suivant le traitement

respectivement. Cette conformation a permis de potentialiser l’efficacité de la PTX tout

en ciblant son action due à la présence de Cathepsin B dans les tissus tumoraux.

En PDT, des dendrimères composés de 18 molécules de 5-acide aminolévulinique

(ALA) couplés par des liens ester au dendrimère ont été synthétisés [230]. L’ALA est une

prodrogue qui va induire, via la voie de l’hème, la synthèse intracellulaire d’un

photosensibilisateur : la protoporphyrine IX (PpIX). Grâce au clivage des liaisons ester,

une fois dans la cellule, les molécules d’ALA sont libérées et génèrent la PpIX [233]. Des

études ont montré une production plus efficace et continue de PpIX avec les dendrimères

comparé à l’ALA après leur administration intra-péritonéale chez des rongeurs ou après

leur administration topique [231], [232] et systémique chez des souris xénogreffées [247].

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Les NPs (G4.5-Ce6+/-PEG) composées de dendrimère PAMAM fonctionnalisé avec

la Ce6 via un lien amide ont démontré, dans le chapitre 4, des faibles rendements

quantiques de fluorescence et d’oxygène singulet qui limitent leur utilisation en imagerie

de fluorescence sur petit animal, et leur efficacité PDT. Pour pallier ces limitations,

l’utilisation d’une liaison clivable reliant la Ce6 au dendrimère semble être une solution

intéressante. Le clivage de la Ce6 permettrait de relarguer la Ce6 qui sous forme libre

retrouverait ses propriétés photophysiques initiales et son efficacité PDT.

Dans la présente étude des dendrimères de Génération 5 présentant 128 groupements

alcool en périphéries, ont été fonctionnalisés avec la Ce6 via des liaisons esters. Leur

caractérisation a notamment mis en évidence en solution que la production d’oxygène

singulet (espèce cytotoxique majoritairement responsable de l’effet PDT) de la Ce6 était

inhibée par son greffage au dendrimère puis restaurée après son clivage. Cette étude

préliminaire a montré la potentialité de ces NPs pour de futures études d’efficacité PDT

in vitro et in vivo.

5.2 Matériels et méthodes

Dans le document Conception et optimisation de nanoparticules dendrimériques photoactivables dans le cadre d'un traitement photodynamique (Page 110-116)