Les résultats

Dans la continuité de l’étude de Pierre Soule nous avons décidé d’utiliser les cellules CHO-K1 pour "les expériences d’électrophysiologie". Ce sont des cellules adhérentes ce qui n’est pas le type cellulaire classiquement utilisé avec la technique de "patch-clamp". Nous devons les décoller pour coupler la mesure électrique avec la mesure de force par BFP. Nous avons dû vérifier dans un premier temps qu’il était possible avec notre montage d’effectuer des expériences de patch-clamp avec des cellules supendues. Nous avons obtenu sur une dizaine de cellules CHO-K1 le "Gigaseal" puis les avons percées. Il est donc possible de mettre en

II.4. COUPLAGE DES MESURES DE FORCE ET D’ÉLECTROPHYSIOLOGIE

place la technique de "patch-clamp" avec des cellules adhérentes de type CHO K1.

L’étape suivante a été de chercher à faire un "Gigaseal" sur une cellule CHO-K1 décollée mais le protocole développé pour les mesures en BFP s’est révélé inadapté pour l’électro-physiologie. Le calcium est essentiel à l’adhérence des cellules or l’EDTA est un chélateur du calcium, il permet donc de décoller la cellule et lui fait perdre sa capacité d’adhérence aux surfaces. Bien que le milieu extracellulaire contienne du calcium il semble que le re-couvrement de l’adhérence ne soit pas instantané pour les cellules décollées qui sont dans l’incapacité d’adhérer au verre de la pipette et de former le "Gigaseal". Nous avons donc modifié le protocole en conséquence. Suite au décollement, les cellules sont suspendues dans 1 mL de milieu DMEM/F12 avec 10 % de sérum et placées à 37˚C pendant deux heures sous agitation pour éviter qu’elles ne se déposent et adhèrent au tube. Elles sont finalement centrifugées cinq minutes à 750 g, le surnageant est évacué, puis resuspendues dans 100 à 200

µL de milieu avant de pouvoir être utilisées. Cette méthode a permis d’obtenir dans certains

cas le "Gigaseal" mais jamais de percer les cellules, un nouveau protocole a donc été élaboré. Les cellules ont été décollées manuellement avec un grattoir adapté en polyéthylène et stérile (Costar de chez Corning Incorporated). Elles sont ensuite récupérées, centrifugées et utilisées immédiatement (figureII.18). Nous apportons ici une nouveauté en levant deux dif-ficultés techniques majeures : coupler des mesures de courants et de forces dans un montage capable d’opérer à une dizaine de pN et à une dizaine de pA ainsi que réaliser des mesures d’électrophysiologie en "voltage-clamp" sur des cellules adhérantes décollées mécaniquement. Des mesures couplées en BFP et électrophysiologie ont ainsi pu être réalisées avec ce type de préparation (figure II.19). Deux cellules ont fait l’objet de mesure avec une sonde non fonctionnalisée à la Pénétratine (la bille de verre ne présentait pas de Pénétratine à sa surface). Le taux d’adhésion est de 10 % (3 forces détectées sur 30 courbes exploitables). Dans le cadre des billes fonctionnalisées avec de la "biotine-aminipentanoyl-Pénétratine", nous avons réussi à obtenir 5 "gigaseal" mais c’est avec seulement deux cellules que nous avons pu aller jusqu’au bout des mesures (percer les cellules pour se placer en mode "whole cell"). La première cellule présente un taux d’adhésion de 9 % (2 sur 23), la seconde de 12 % (8 sur 67). L’analyse des mesures électriques n’a, à ce jour, rien révélé de notable mais est toujours en cours.

Nous avons donc réussi avec notre montage à réaliser une mesure de force en BFP sur une cellule CHO K1 décollée et une mesure électrique par la technique de "patch-clamp". Cependant il semble que les billes utilisées pour la sonde de force n’aient pas été correctement fonctionnalisées car le taux d’adhésion est proche du taux d’adhésion non spécifique. L’étape pendant laquelle la Pénétratine est déposée sur la bille n’a pas été correctement réalisée. De plus nous n’avons pas réussi à ce jour à synchroniser la mesure de force et l’enregistrement électrique, nous ne sommes donc pas capable d’associer une courbe de force avec l’enregis-trement électrique correspondant. Sur les enregisl’enregis-trements électriques aucune modification notable du courant n’a été observée mais nous apportons ici la preuve de concept que ce couplage des techniques BFP et d’électrophysiologie est, en pratique, possible. De nouvelles expériences devraient être menées pour pousser plus loin cette étude mais n’ont pas, à ce jour, été réalisées. Ce projet devrait se poursuivre dans le cadre de la thèse de Nathalie Dhayer qui commencera en septembre 2018.

Fig. II.18 Photos d’une cellule CHO K1 décollée avant (A) et après (B) la formation du "gigaseal". Le courant électrique (en bleu) enregistré avec le logiciel clampex est également présenté. On peut observer (dans le carré rouge) la résistance passant de 35 M Ω à 1, 6 GΩ.

II.4. COUPLAGE DES MESURES DE FORCE ET D’ÉLECTROPHYSIOLOGIE

Fig. II.19 Photo du dispositif en place du couplage BFP et "électrophysiologie". L’enre-gistrement du courant électrique correspondant à la photo (gain de l’amplificateur x5) est présenté avec la présence des courants capacitifs typiques de la technique de "patch-clamp" (entouré en noir). De plus la résistance de pipette mesurée est supérieure au gigaohm (elle se déduit de la loi d’Ohm U = R × I avec I la différence de courant entre les deux plateaux de la courbe) donc le gigaseal est réalisé sans fuite de courant. Le "patch-clamp" est correctement en place. En rouge est représentée la tension imposée entre les deux électrodes.

III – L’activité des CPPs sur des

membranes modèles

Nous nous sommes intéressés dans ce travail thèse aux interactions entre peptides pé-nétrants et membranes. Cependant une membrane biologique constitue un environnement extrêmement complexe, avec des composants très nombreux et de natures différentes (des lipides, des protéines membranaires, le glycocalyx...). Bien sûr, il est possible de mesurer des interactions directement sur une membrane biologique naturelle, comme nous l’avons vu au chapitre précédent, mais il peut être intéressant d’utiliser un système modèle pour mieux appréhender les interactions protéines-lipides et en particulier l’interaction d’un peptide pé-nétrant avec la bicouche lipidique de la membrane plasmique. Une membrane modèle est une reproduction simplifiée d’une membrane naturelle dans lequel l’expérimentateur peut contrô-ler différents paramètres. Les systèmes modèles de membrane sont essentiels à la compréhen-sion des mécanismes d’interactions entre protéines et membranes. Ils permettent notamment de contrôler les propriétés physicochimiques, de s’affranchir de la machinerie cellulaire et de contrôler la composition en lipides de la membrane. Une approche électrique est souvent utilisée pour décrire les membranes modèles, apportant ainsi des informations précises sur ses caractéristiques. Rappelons donc ici qu’une bicouche lipidique se comporte d’un point de vue électrique comme une résistance en parallèle avec une capacité (figureIII.1).

Fig. III.1 Schéma électrique équivalent d’une bicouche lipidique. R et C sont respectivement la résistance et la capacité de la bicouche lipidique.

III.1 Les membranes artificielles comme modèle

Il existe de nombreux systèmes modèles de membrane biologique dont certains seront présentés dans ce chapitre de manière non exhaustive avec leurs avantages et leurs incon-vénients. Nous essayerons ici de déterminer en quoi le modèle de "Bicouche à l’Interface de Gouttes" (BIG) constitue un modèle expérimental particulièrement intéressant pour notre étude.