Résultats et discussion
IV) Résultats biologiques
IV.1) Introduction
L’activité antifongique des molécules d’intérêt synthétisées a été évaluée sur différents pathogènes d’importance agronomique. Pour chacun des composés évalués, deux tests ont été effectués : un test sur champignon isolé et un test sur plante. Les souches des champignons retenues pour chacun des tests constituent un panel représentatif de la plupart des maladies présentes au sein des cultures dans le monde entier.172 Pour ne citer que quelques exemples, on trouve notamment des pathogènes responsables des principales maladies des céréales ou des cultures légumières. Des pathogènes pouvant attaquer le riz sont également représentés et leur contrôle représente un marché particulièrement important dans les pays d’Asie.
Afin d’illustrer nos propos, un exemple d’infestation d’une feuille de soja par le champignon
Phakopsora pachyrhizi après 24 h d’incubation est montré sur la photo ci-dessous (Figure
29). On observe ici que le pathogène a traversé la cuticule pour envahir la couche palissadique.
Figure 29173
172 Pour des raisons de confidentialités, le nom des pathogènes utilisés pour les tests ne sont pas mentionnés ici. Chaque pathogène a été désigné par son sigle à 6 lettres dans les tableaux de résultats (code EPPO).
IV.1.1) Le test sur champignon isolé
Le test sur champignon isolé est un test in vivo. Chaque pathogène de ce test a été inoculé dans un puits de plaque de culture cellulaire contenant le composé à tester, dilué à une certaine concentration dans un milieu de culture approprié. L’objectif de ce test est de déterminer tout d’abord si le produit-test empêche la croissance du champignon, et si tel est le cas, jusqu’à quelle concentration le fait-il, sachant que plus le produit est efficace, plus cette concentration sera minime. Après un temps d’incubation propre à chaque champignon, l’efficacité des composés est évaluée par mesure d’absorbance (Figure 30).
Figure 30
Plus le champignon s’est développé, et donc moins le produit-test a été efficace, plus la densité optique (DO) mesurée est élevée. La DO correspondant à chaque concentration testée est ainsi mesurée. Si un composé est actif, la courbe DO=f(C) permet de déterminer la DE50
du composé, c’est à dire la concentration en produit pour laquelle on observe 50 % d’inhibition de la croissance du pathogène (Figure 31).
Ce test permet de détecter une activité en mettant en œuvre de très petites quantités de produit et donnent une première idée de l’efficacité d’un composé. Néanmoins, on mesure l’effet direct du produit sur le champignon isolé ce qui n’est pas le cas dans les conditions réelles d’utilisation des fongicides en agriculture. En effet, la plante elle-même peut représenter une barrière entre la molécule active et le champignon. De plus, la phytotoxicité du produit ne peut pas être évaluée ici.
Un deuxième test a donc été effectué sur les composés d’intérêt : le test sur plante IV.1.2) Le test sur plante
Le test sur plante permet d’évaluer l’activité d’un composé directement sur une plante en culture. Il a été effectué en deux étapes : le produit à tester a tout d’abord été pulvérisé à deux concentrations différentes sur de jeunes plantes, hôtes spécifiques des pathogènes. Puis, après un temps de séchage, la plante a été contaminée par le champignon correspondant (Figure 32). L’efficacité du produit et son éventuelle phytotoxicité ont été observés visuellement après plusieurs jours d’incubation.
En plus des composés-test, chaque essai comprend également des témoins solvants négatifs qui permettent de vérifier le bon développement de la maladie ainsi que des témoins positifs (avec des fongicides commerciaux) qui permettent de valider la qualité de l’essai
Au bout d’un temps d’incubation propre à chaque pathogène, les biologistes ont évalué visuellement le pourcentage de la surface de la plante infectée par rapport aux plantes témoins solvant.174 A partir de ces observations visuelles, ils ont calculé un pourcentage d’efficacité du composé-test. La phytotoxicité du produit a également été observée. Celle-ci peut se manifester par des symptômes d’attaque (nécrose d’une partie ou de la totalité de la plante, chlorose) ou par des symptômes hormonaux (modification de la taille de la plante).
Le potentiel fongicide des intermédiaires et des analogues synthétisés a été évalué dans ces deux types de tests. Dans un premier temps, l’évaluation de l’activité antifongique de la gougérotine est rapportée.
IV.2) Résultats biologiques
Tous les résultats présentés dans ce chapitre sont issus de tests dits préventifs, c’est-à-dire que le composé a été déposé sur la plante avant le pathogène.
IV.2.1) Evaluation de l’activité antifongique de la gougérotine
Figure 33
Dans un premier temps, l’activité antifongique de la gougérotine, représentée Figure 33, a été évaluée sur la molécule obtenue à partir de la fermentation d’une bactérie, Streptomyces
microflavius. La gougérotine a pu être isolée à 80 % en mélange avec d’autres métabolites.3
Seul le test sur plante a été réalisé ici et les résultats sont résumés dans le Tableau 12 (les pathogènes sur lesquels l’efficacité est la plus importante sont présentés).
174 Pour des raisons de confidentialité, le temps d’incubation, l’âge des plantes et les symptômes observés ne sont pas communiqués ici. O N OH OH HN N O NH2 H2N O O H N OH O N H 1 LogP = -3,53
[C]
(ppm) SPHRFU UROMAP PUCCRT SEPTTR PYRNTE LEPTNO
250 83 % 100 %
(30 %) 100 % 100 % 86 % 57 %
Tableau 12 : Gougérotine 80 % dans milieu de fermentation. Valeurs de l’efficacité (+phytotoxicité si il y a).
La gougérotine issue du milieu de fermentation est donc active sur la majorité des pathogènes fongiques testés. Elle présente cependant parfois une phytotoxicité importante, comme rapporté dans le test sur UROMAP par exemple. On peut noter que la gougérotine possède un logP très bas (-3,53)175 comparé aux attentes vis à vis des composés antifongiques (2 < logP < 4, voir partie II.4.1). Il s’agit donc d’une molécule particulièrement polaire. On peut supposer que les métabolites secondaires présents peuvent jouer le rôle d’agents pénétrants ou sont eux-mêmes actifs. D’après ces résultats, la gougérotine est une candidate potentielle pour l’élaboration d’un nouveau composé antifongique. Comme décrit dans la partie précédente, des analogues et des intermédiaires simplifiés de la gougérotine ont été synthétisés. L’évaluation de leur activité biologique est présentée dans la partie suivante. Dans un deuxième temps, la gougérotine obtenue par voie chimique (synthétisée au laboratoire Bayer) a elle-même été évaluée. Les résultats sont présentés dans le Tableau 13.
[C]
(ppm) SPHRFU UROMAP PUCCRT SEPTTR PYRNTE LEPTNO
250 85 % 9 % 0 % 86 % 22 % 38 %
Tableau 13 : Gougérotine obtenue par voie chimique. Valeurs de l’efficacité.
Sur un échantillon purifié, la gougérotine perd son activité sur quelques champignons comme par exemple UROMAP et PUCCRT. On suppose qu’il s’agit principalement d’un problème de biodisponibilité. La formulation du composé actif joue donc un rôle important dans son activité. Cependant, la gougérotine synthétisée reste efficace face à SPHFRU et SEPTTR. Les résultats biologiques concernant les analogues déprotégés I-L et I-D sont présentés dans le paragraphe suivant.