La révélation des composants bactériens dans les tumeurs mammaires
humaines par IHC et FISH.
La présence et la distribution de bactéries intratumorales dans les tumeurs du sein humain ont été très peu caractérisées. Ainsi, des composants bactériens ont été révélés sur des tranches de tumeurs du sein entier en utilisant deux techniques de marquage : l’IHC et le FISH (techniques résumées à la Figure 5).
Figure 5. – Représentation des marquages utilisés pour la détection des composants bactériens dans les tumeurs mammaires.
Illustrations des techniques d'IHC et de FISH utilisées pour la détection de bactéries sur des tranches de tissu mammaire FFPE de 4 μm. Les marquages en IHC et en FISH ont été réalisés sur des tranches de tumeurs entières. (gauche) Le LPS et le PGLY de la paroi cellulaire des bactéries ont été ciblés par des anticorps grâce à l’IHC. Les tissus ont été contre-colorés avec de l'hématoxyline. (droite) L’ARNr 16s des bactéries a été ciblé avec une sonde fluorescente, la EUB338-AF647, en utilisant le FISH. Les tissus ont été contre-colorés avec le Hoechst 33342 (fluorescence bleue).
Pour la détection des bactéries avec l'IHC, nous avons utilisé un anticorps anti-LPS ciblant la membrane externe de certaines bactéries Gram négatif et un anticorps anti-PGLY ciblant la paroi cellulaire de toutes les bactéries (Figure 5). Tout d'abord, la spécificité des anticorps a été validée sur des cellules FFPE d’E. coli et de MDA-MB-231. Les deux anticorps ont montré une liaison non spécifique minimale dans la lignée cellulaire de cancer du sein, tout en étant capables
de marquer les E. coli sur des lames (Figure S1A). Ensuite, le marquage des bactéries avec ces anticorps sur des coupes de tumeurs mammaires a permis de révéler la présence de composants bactériens (LPS et PGLY) dans le microenvironnement tumoral (Figure 6, A et B). Ces marquages ont été comparés à un contrôle isotype pour évaluer le signal de fond non spécifique et valider notre détection bactérienne sur les tissus mammaires. Les résultats suggèrent une infiltration des bactéries dans les agrégats de cellules tumorales dans le sein comme le démontre la Figure 6A. Dans le microenvironnement tumoral, les composants bactériens sont principalement observés dans les tissus conjonctifs: le tissu adipeux et le stroma. De plus, pour certaines patientes, le marquage a révélé une quantité importante de composants bactériens localisés dans les cytoplasmes de cellules des canaux lactiques (Figure 6B). Une coloration à l'hématoxyline et à l'éosine (HE) a été réalisée, et des cellules ressemblant à des macrophages ont été observées dans ces canaux (Figure 7A). La présence de macrophages dans les canaux lactifères a été confirmée avec un marquage anti-CD68 en utilisant l’IF (Figure S1C pour validation du marquage)
Figure 6. – Révélation des composants bactériens dans le microenvironnement de la tumeur mammaire humaine à l’aide de l’IHC.
Photos représentatives des marquages du LPS et du PGLY bactériens en IHC dans (A) les tumeurs du sein humain ou (B) les tissus du microenvironnement tumoral. Les noyaux des tissus ont été contre-colorés avec de l’hématoxyline.
Figure 7. – Validation de la présence et localisation des bactéries du microenvironnement tumoral et de l’identité des cellules immunitaires qui leur sont associées avec le FISH et l’IF. (A) La morphologie des cellules associées aux bactéries dans les canaux lactifères a été analysée par coloration à l’HE. Les cellules ont également été marquées avec un anticorps anti-CD68 en utilisant l’IF et contre-colorées avec le Hoechst 33342 (coloration bleue). Un marquage FISH a été réalisé pour confirmer la présence de composants bactériens dans (B) les tumeurs du sein humain et (C) les tissus adjacents en utilisant une sonde fluorescente (AF647) qui cible l’ARNr 16S.
En ciblant l'ARNr bactérien 16S avec une sonde conjuguée à une molécule fluorescente (EUB338-AF647) grâce au FISH, la détection de bactéries sur les mêmes tranches tumorales a été confirmée. La spécificité de la sonde EUB338 a été contrôlée avec la même expérience utilisée pour évaluer la liaison spécifique des anticorps utilisés en IHC. Elle semble beaucoup plus spécifique aux composants bactériens puisqu’aucun marquage non spécifique n’est observé dans la lignée cellulaire MDA-MB-231 (Figure S1B). Le marquage de l’ARNr 16S par la sonde a permis de révéler des bactéries dans le tissu tumoral mammaire de la même façon que les composants bactériens (LPS et PGLY) ciblés en utilisant l’IHC, montrant également l’affinité des bactéries pour les tissus conjonctifs (Figure 7, B et C). Le signal positif de l’EUB338 a été validé en le comparant à une sonde contrôle NonEUB qui permet de déterminer la spécificité de la liaison de la sonde dans les tissus mammaires. Du marquage non spécifique est observable comme on le voit à la Figure 7B. Cependant, si l’IHC ne permet pas l’observation des cocci et bâtonnets à cause de la diffusion du chromogène, le FISH donne un signal beaucoup plus précis. Ainsi, le signal positif de l’EUB338 est convaincant puisqu’il est similaire en taille (≈1 μm) et en forme (bâtonnet) à celui attendu d’une bactérie, en plus de se différencier du signal non spécifique obtenu avec la sonde NonEUB. Pour finir, autant le LPS, le PGLY et l’ARNr 16S sont révélés principalement dans l’environnement extracellulaire, mis à part pour les canaux lactifères où les composants bactériens détectés avec l’IHC sont retrouvés dans le milieu intracellulaire des macrophages.
La détection des différents composants bactériens sur des coupes de tumeurs du sein suggère fortement que les bactéries peuvent infiltrer le microenvironnement tumoral en contexte de cancer du sein. De plus, les bactéries associées aux macrophages dans les canaux lactifères supportent l'hypothèse que la présence bactérienne dans le microenvironnement intratumoral pourrait façonner la réponse immunitaire antitumorale.
Quantification des composants bactériens dans les tumeurs du sein par
qPCR.
Pour caractériser davantage la présence du microbiote dans les tumeurs du sein humain, une méthode qPCR a été optimisée pour quantifier la charge bactérienne dans les échantillons de tumeurs de notre cohorte (Tableau 3) en utilisant E. coli comme bactérie de référence.
Premièrement, la technique qPCR quantifiant l'ADN codant l'ARNr bactérien 16S a été validée en testant sa sensibilité et sa reproductibilité dans des échantillons de tumeurs. Pour évaluer si notre qPCR pouvait faire la différence entre une tumeur avec de l'ADN bactérien indétectable et une tumeur avec de l'ADN bactérien, nous avons inoculé des fragments de tumeur qui ont un compte bactérien sous la limite de détection (Tumeur #1 et #2) avec une suspension d'E. coli de quantité connue avant l'extraction de l'ADN (Figure S3A - gauche). Le seuil de détection a été établi à 11.9 ± 5.2 équivalents bactériens (Éq. bac.), résultat d’une liaison non spécifique des amorces à l'ADN humain seul. L'inoculation avec du milieu LB contenant des E. coli (B1 et B2) a augmenté la détection des Éq. bac. dans les fragments de tumeur au-dessus de la limite de détection, contrairement aux fragments de tumeur supplémentés uniquement avec le milieu LB (LB #1 et #2). L'expérience a confirmé que la technique de qPCR était capable de détecter une présence artificielle de bactéries dans des échantillons de tumeurs. De plus, les Éq. bac. quantifiés dans chaque fragment de tumeur n'étaient pas significativement différents de la quantité de bactéries ajoutées à l'étape d'extraction (Figure S3A - droite). Ensuite, pour évaluer la sensibilité de la technique, l'ADN d'une tumeur du sein a été extrait et 150 ng de cet ADN tumoral ont été mélangés à des dilutions prédéterminées d'ADN bactérien allant de 10 000 à 1 Éq. bac. (TB 1 à 13) (Figure S3B). Dans l'ensemble, la technique qPCR a détecté avec précision la quantité supplémentaire d'ADN bactériens (TB 2 à 9). Les échantillons supplémentés avec une quantité d'ADN bactériens supérieure à la gamme d’étalonnage couverte par les standards (TB 1) étaient les seuls à montrer une différence significative entre la quantité ajoutée et détectée d'ADN bactérien (p<0.0001). De plus, nous avons observé une perte de précision dans la quantification bactérienne des échantillons sous la limite de détection (TB 10 à 13). Enfin, la reproductibilité de la technique a été testée en répétant la quantification sur le même échantillon comme le montre la Figure S3C. Ces résultats montrent que la quantification qPCR des gènes de l’ARNr 16S est sensible et reproductible, ce qui permet une quantification précise du nombre d'Éq. bac. dans les échantillons de tumeurs du sein.
Figure 8. – Quantification des équivalents bactériens dans le cancer du sein et le tissu normal adjacent à partir de l’ADN codant pour l’ARNr 16S bactérien
(A) Un échantillon d'ADN extrait d’un fragment de tumeur du sein (1-4 fragment/tumeur) a été testé avec la quantification qPCR du gène de l’ARNr 16S pour quantifier la présence de bactéries chez les patientes atteintes d'un cancer du sein (N=114). La quantification moyenne des fragments a été utilisée pour trier les patientes par ordre croissant. La médiane (14.7 Éq. bac.) de la quantification moyenne a été utilisée pour séparer les patientes dans les groupes de détection bactérienne faible ou élevée. (B) Comparaison entre la quantification des Éq. bac. dans les NAT (N=16) et le nombre quantifié dans les tumeurs appariées (gauche). La corrélation entre les Éq. bac. quantifiés dans les tumeurs et les NAT appariés a également été évaluée (droite). (C) Charge bactérienne moyenne dans les tumeurs classées en fonction des données cliniques du patient, soit le stade pTNM (gauche) ou le grade (droite). Les barres d'erreur représentent la moyenne ± écart-type.
Ensuite, la technique qPCR a été utilisée pour quantifier les Éq. bac. dans les fragments de tumeur (1 à 4 fragments) de 114 patientes avec un cancer du sein. Les patientes ont été classées en fonction de la moyenne de la quantification de leurs fragments (Figure 8A). Certaines patientes
avaient des Éq. bac. relativement élevés (Max=215.7 Éq. bac.) dans leur tumeur par rapport à d'autres patientes ayant plusieurs fragments sous le seuil de détection (Min=2.3 Éq. bac.). Par ailleurs, pour certaines patientes, la charge bactérienne était variable entre leurs fragments tumoraux, ayant des fragments avec et sans bactéries. Cela pourrait indiquer une infiltration hétérogène des bactéries dans les tumeurs du sein. Dans la cohorte, la majorité des patientes (60 %) avaient une quantification moyenne d'ADN bactérien supérieure à la limite de détection établie par la quantification moyenne de l'ADN humain seul (11.9 ± 5.2 Éq. bac.). Nous n'avons trouvé aucune association entre le stade pTNM simplifié et la quantification bactérienne, mais nous avons constaté que le nombre de bactéries était plus faible dans les tumeurs de grade III que de grade I-II (p=0.038) (Figure 8C). Ces résultats suggèrent que la charge bactérienne pourrait être importante pour le pronostic des patientes atteintes du cancer du sein.
Enfin, pour comparer la charge bactérienne dans la tumeur du sein avec des tissus sains appariés, nous avons évalué le contenu bactérien dans les NAT en utilisant la qPCR. Il y avait une différence significative (p<0.0001) entre les tumeurs (23.8 ± 17.1 Éq. bac.) et les NAT appariés (151.7 ± 206.8). Nous avons détecté six fois plus de bactéries dans les tissus sains autour de la tumeur (Figure 8B - gauche). En outre, une corrélation positive (R=0.53) a été observée entre la charge bactérienne des tumeurs et des NAT appariés (Figure 8B - droite). Les patientes avec la plus grande quantité de bactéries dans leur NAT avaient également le microbiote intratumoral le plus important.
La dichotomisation de la cohorte selon la quantification des bactéries
intratumorales n’induit pas de facteurs confondants.
Pour évaluer l'effet de la détection bactérienne sur les résultats cliniques des patientes de notre cohorte de cancer du sein, nous avons dichotomisé notre cohorte en deux groupes (Figure 8A) selon la médiane de la quantification moyenne (14.7 Éq. bac.) des Éq. bac.: une charge bactérienne intratumorale faible (Éq. bac. < 14.7) ou élevée (Éq. bac. ≥ 14.7).
Selon les données cliniques des patientes dans chaque groupe, nous avons trouvé une association entre la détection bactérienne et la récidive (p=0.018), avec 20/29 (69 %) récidives locorégionales et distantes se produisant dans le groupe de détection bactérienne faible (Tableau
3). De plus, l'association entre la détection bactérienne et la survie globale était proche de la signification (p=0.082) avec 18/28 (64 %) décès survenant chez les patientes avec un faible contenu bactérien dans leur tumeur. Cela suggère qu'une charge bactérienne faible dans les tumeurs pourrait se traduire par un mauvais pronostic pour les patientes avec un cancer du sein. Par conséquent, cela nous a amenés à évaluer l'impact de la détection bactérienne intratumorale sur les résultats cliniques des patientes avec un cancer du sein grâce à des analyses de survie de Kaplan-Meier.
Tout d’abord, pour déterminer si la séparation des patientes en deux groupes aurait pu créer des facteurs confondants, nous avons contrôlé plusieurs variables clinicopathologiques telles que l'âge, le sexe, le type de cancer, le stade pathologique, le grade et les traitements antérieurs reçus (Tableau 3). Aucune association n'a été trouvée entre la détection bactérienne et la majorité des variables clinicopathologiques testées. Or, nous avons obtenu significativement plus de patientes traitées par hormonothérapie néoadjuvante dans le groupe de détection bactérienne faible (p=0.027). Cette variable pourrait être un facteur de confusion potentiel dans l'analyse de survie. Cependant, comme les patientes traitées par hormonothérapie néoadjuvante ne représentent qu'une petite partie de notre cohorte (N=6), leur impact sur l'analyse serait donc mineur. Puis, les bactéries intratumorales de chaque groupe de détection bactérienne ont été identifiées et analysées afin de déterminer si leur composition microbienne diverge, et pourrait ainsi être responsable en partie des résultats obtenus par les analyses de survie.
Tableau 3. – Caractéristiques clinicopathologiques de la cohorte du cancer du sein et leur association avec la quantification bactérienne.
Caractéristiques Cohorte entière, n (%) Faible, n (%) Élevée, n (%) Détection bactérienne Valeur p
n 114 (100) 57 (100) 57(100)
Sexe, Femelle 113 (99) 57 (100) 56 (98) 1.000
Temps de suivi (Mois) 0.851
Médiane (EI) 72 (37-105) 72 (38-108) 71 (37-105)
< 70 55 (48) 27 (47) 26 (46)
≥ 70 59 (52) 30 (53) 31 (54)
Âge au diagnostic (Années) 0.574
Médiane (EI) 61 (50-71) 62 (52-75) 59 (49-67) < 60 55 (48) 26 (46) 29 (51) ≥ 60 59 (52) 31 (54) 28 (49) Statut de la ménopause* 0.441 Préménopause 24 (21) 14 (25) 10 (18) Postménopause 79 (69) 39 (68) 40 (70)
Type d’intervention chirurgical 0.277 Tumorectomie 67 (59) 36 (63) 31 (54) Mastectomie 44 (39) 19 (33) 25 (44)
Type de cancer du sein 0.658
Carcinome invasif tubulaire 9 (8) 3 (5) 6 (11) Carcinome invasif canalaire 85 (75) 44 (77) 41 (72)
Autres 20 (18) 10 (18) 10 (18)
Sous-type de cancer du sein 0.377
Luminal A 29 (25) 16 (28) 13 (23) Luminal B-like-HER2- 22 (19) 9 (16) 13 (23) Luminal B-like-HER2+ 25 (22) 10 (18) 15 (26) HER2+ (non-luminal) 12 (11) 5 (9) 7 (12) Triple-négatif 25 (22) 16 (28) 9 (16) Stade pathologique T 0.256 pT 0-1 41 (36) 19 (33) 22 (39) pT 2 58 (51) 32 (56) 26 (46) pT 3-4 13 (11) 4 (7) 9 (16) Stade pathologique N 0.567 pN 0 53 (46) 28 (49) 25 (44) pN 1-3 57 (50) 27 (47) 30 (53) Grade de Nottingham 0.235 I 8 (7) 5 (9) 3 (5) II 36 (32) 14 (25) 22 (39) III 70 (61) 38 (67) 32 (56) Thérapie adjuvante 0.406 Non 15 (13) 9 (16) 6 (12) Oui 99 (87) 48 (84) 51 (89) Chimiothérapie 0.452 Non 52 (46) 28 (49) 24 (42) Oui 62 (54) 29 (51) 33 (58) Hormonothérapie 0.255 Non 48 (42) 27 (47) 21 (37) Oui 66 (58) 30 (53) 36 (63) Radiothérapie 0.548 Non 37 (32) 17 (30) 20 (35) Oui 77 (68) 40 (70) 37 (65) Thérapie néoadjuvant 0.022 Non 100 (88) 46 (81) 54 (95) Oui 14 (12) 11 (19) 3 (5) Chimiothérapie 1.000 Non 107 (94) 53 (93) 54 (95) Oui 7 (6) 4 (7) 3 (5) Hormonothérapie 0.027 Non 108 (95) 51 (89) 57 (100) Oui 6 (5) 6 (11) 0 (0) Radiothérapie 0.496 Non 112 (98) 55 (96) 57 (100) Oui 2 (2) 2 (4) 0 (0)
Récidive (locorégionale ou distante) 29 (25) 20 (35) 9 (16) 0.046 Décès global 28 (25) 18 (32) 10 (18) 0.082 EI : Écart interquartile; ER : Récepteur d’estrogènes; PR : Récepteur de progestérone
* Imputation de la ménopause: les valeurs manquantes pour les femmes ont été imputée comme préménopausée (moins de 45 ans) ou postménopausée (plus de 55 ans).
La composition du microbiote intratumoral mammaire n’est pas
significativement différente entre les deux groupes de détection.
Pour évaluer si la dichotomisation des patientes et les analyses de survie qui en découlent sont influencées par la composition microbienne spécifique à chaque groupe de détection qPCR, 10 échantillons d’ADN tumoral contenant une quantité bactérienne faible et 24 échantillons d’ADN tumoral contenant une quantité bactérienne élevée ont été séquencés, puis comparés.
La composition générale du microbiote au niveau taxonomique du phylum et du genre a tout d’abord été déterminée pour les deux groupes de détection bactérienne (Figure 9A). La composition bactérienne des échantillons de tumeurs mammaires montre une distribution homogène entre les échantillons d’une quantité abondante de protéobactéries (autour de 70-80 %), puis de firmicutes et d’actinobactéries en quantité moins importante (environ 5-10 %). Ces résultats sont comparables à ceux obtenus lors des études de Xuan et al. et Urbaniak et al. qui caractérisaient le microbiote de la tumeur du sein et du NAT. À part pour les cyanobactéries et les bactéroïdètes observés dans une minorité d’échantillons du groupe élevée, les compositions bactériennes entre les groupes ne divergent pas à l’analyse des phylums et des genres.
Figure 9. – La composition et la diversité du microbiote intratumoral ne se différencient pas en fonction de la dichotomisation qPCR de la cohorte du cancer du sein.
(A) Diagramme à barres représentant la composition bactérienne des échantillons tumoraux au niveau du phylum et du genre. L’abondance relative est illustrée pour chaque échantillon (0-100 %) (B) Graphique à boites représentant la diversité alpha calculée avec les indices de Shannon et de Simpson. (C) Bêta diversité déterminée avec un NMDS basé sur l’indice de dissimilarité de
Pour explorer plus en profondeur les différences dans la composition bactérienne entre les deux groupes de détection, les diversités alpha et bêta ont été évaluées. Malgré une légère tendance à la hausse pour le nombre d’espèces bactériennes (Shannon) et leur uniformité (Simpson) dans les échantillons tumoraux avec une quantification bactérienne élevée, l’analyse de ces indices n’a pas permis de trouver une différence significative (Shannon, p=0.189; Simpson, p=0.262) dans la diversité alpha des deux groupes (Figure 9B). Par la suite, la quantité de taxa spécifiques à chaque groupe a été déterminée en comparant les deux groupes avec l’analyse de positionnement multidimensionnel non métrique (non-metric multidimensional scaling, NMDS). L’analyse montre une similarité entre les données des deux groupes, puisqu’aucune séparation évidente n’est observable (Figure 9C). Pour s’assurer de la ressemblance entre la composition bactérienne des deux groupes, une analyse LEfSe pour identifier les ASV enrichis dans chaque groupe de détection a été réalisée. Après la correction de la valeur p avec le FDR (false discovery
rate), aucune bactérie significativement plus abondante dans un des groupes n’a pu être
identifiée, validant ainsi l’homogénéité de la composition bactérienne dans les échantillons tumoraux de la cohorte malgré sa dichotomisation (données non illustrées).
Une quantification bactérienne importante dans la tumeur du sein est
associée à un meilleur devenir clinique des patientes.
L'analyse de Kaplan-Meier a démontré une différence significative du risque de récidive entre les patientes avec une charge bactérienne élevée et faible (p=0.01) (Figure 10A), présentant un DFS après 5 ans de 86.7 % contre 67.7 % respectivement. Une tendance pour une meilleure OS des patientes possédant une charge bactérienne intratumorale élevée a également pu être observée, principalement dans les premiers mois après la chirurgie (Wilcoxon: p=0.081) (Figure S4A). La OS à 5 ans était de 86.7 % pour le groupe de détection élevée, contre 71.8 % pour le groupe de détection faible (p=0.081).
Figure 10. – Évaluation de la survie sans récidive des patientes séparées en fonction de la quantification de leurs équivalents bactériens
(A) Courbe de Kaplan-Meier pour la DFS de toute la cohorte classée en deux groupes, faible ou élevée, déterminés selon le nombre d’Éq. bac. quantifiés dans leur tumeur avec la technique qPCR. Courbes pour la DFS dans les sous-groupes de patientes avec des Éq. bac. faibles ou élevés classés par (B) le grade, (C) le stade pTNM ou (D) le sous-type de cancer.
Sur la base de ces résultats, la quantification des Éq. bac. dans la tumeur basée sur la qPCR pourrait servir d'outil potentiel afin d’évaluer le risque de récidive pour les patientes avec un cancer du sein, sans tenir compte des autres variables cliniques. Ensuite, la cohorte de cancer du sein a été séparée en fonction du stade pTNM, du grade et du sous-type du cancer afin d’évaluer si l’effet protecteur d'une détection bactérienne intratumorale élevée était spécifique à certains sous-groupes de patientes. Une survie prolongée (Log-rank: p=0.033) et une récidive moins
une détection bactérienne élevée, tandis que les bactéries n'avaient aucun effet protecteur chez les patientes cancéreuses de grade I et II (Figure 10B et Figure S4B). Selon le stade pTNM, des résultats similaires ont été observés quant au plus faible nombre de récidive (Log-rank: p=0.046) chez les patientes cancéreuses de stade III-IV (Figure 10C).
Pour résumer, nous avons remarqué que la quantification bactérienne dans les tumeurs du sein pouvait être utilisée comme facteur pronostique principalement chez les patientes atteintes d'une maladie avancée. De plus, les patientes avec un sous-type luminal HER2+ (voir le
Tableau 1 pour la classification en sous-types moléculaires) étaient les plus affectées par les variations de charge bactérienne dans leur tumeur. Les patientes avec ce sous-type de cancer ayant un faible nombre de bactéries dans leur tumeur avaient significativement plus de récidive (Log-rank: p=0.004) et de décès (p=0.003) (Figure 10D et Figure S4D). Pour ce sous-type, la détection des Éq. bac. pourrait être une indication puissante de la survie à long terme de la patiente et de son risque de récidive. Il y avait également une tendance à un nombre de récidive plus faible chez les patientes avec des sous-types de cancer du sein luminal B (Wilcoxon: p=0.043) ou HER2 surexprimé (Log-rank: p=0,131) avec une charge bactérienne élevée, cependant, ces groupes étaient sous-représentés alors ces résultats devront être validés avec plus de patientes.
Les Tableaux 4 et S1 fournissent les résultats d'analyses univariées effectuées sur plusieurs variables clinicopathologiques et sur l’infiltration bactérienne intratumorale pour valider leur importance clinique. La charge bactérienne a été identifiée comme un facteur pronostique univarié significatif pour le risque de récidive (HR=0.38, p=0.018), mais pas pour la