IV – Caractérisation du montage
IV. 1 – Résolution spatiale
Dans un premier temps, il est indispensable de s’intéresser aux performances spatiales de notre dispositif, afin de déterminer le grossissement et la résolution de notre montage.
IV.1.1 - Résolution latérale
Nous quantifions d’abord la résolution latérale du dispositif. C’est une étape importante qui nous permet de déterminer la taille de ce que l’on observe et de connaître les limites de notre dispositif. Nous commençons par imager une mire avec les deux voies de détection. Cette mire USAF est fournie par Edmund avec la taille de tous les motifs. Ceux imagés sur la figure 3-22 sont les plus petits, avec un nombre de paires de lignes par mm de respectivement 228, 203 et 181.
Figure 3-22 : mire utilisée dans les mesures de calibration. A gauche, schéma du constructeur, au centre, image obtenue sur l’EMCCD, à droite, image obtenue sur la CCD après le HRI.
A partir de ces images, il nous est possible de mesurer le grandissement. Nous trouvons qu’un pixel de la caméra EMCCD correspond à 91 nm dans le plan objet, et qu’un pixel de la caméra CCD (après le HRI) correspond à 87 nm. Nous nous assurons rapidement, que dans les deux cas, cette valeur est proche de celle que l’on peut retrouver par le calcul.
Pour l’EMCCD, un pixel mesure 16 µm de côté, et on trouve un grandissement de 176
091 , 0
16
≈ ;
et pour la CCD, un pixel mesure 6,45×2=12,90µm de coté (à cause du binning), et par
conséquent on trouve : 150 087 , 0 9 , 12
≈ . Or l’objectif est un 60x et le télescope que nous avons construit a un grandissement d’environ 3, ce qui au total fait un grandissement effectif autour de 180. Les valeurs mesurées nous paraissent donc cohérentes, étant donné que nous ne connaissons le grandissement effectif ni de l’objectif, ni de nos télescopes. Nous disposons dès lors d’une calibration spatiale pour toutes nos images, en intensité ou en durée de vie.
Chapitre III : Développement et caractérisation d’un microscope…
Ensuite, nous mesurons la réponse percussionnelle de notre dispositif. Pour cela, nous observons des microsphères Invitrogen de 100 nm excitées à 505 nm et qui fluorescent à 515 nm. Nous les observons avec le cube GFP (filtre pour l’excitation centré à 472 nm avec une largeur de 30 nm, filtre pour la détection centré à 520 nm avec une largeur de 35 nm). Il est intéressant de constater que, dans les deux cas, l’image de cette bille couvre plus d’un pixel. Ceci signifie que, grâce au télescope x3, la résolution est limitée par l’objectif et non pas par l’intensificateur, même si ce dernier la dégrade un peu.
Sur l’EMCCD, nous trouvons que la largeur à mi-hauteur de l’image vaut (en moyenne pour 20 mesures) 350 ± 20 nm dans le plan objet. Sur la CCD, la résolution est un peu moins bonne puisque nous trouvons une largeur à mi-hauteur moyenne (pour 20 mesures) de 395 ± 20 nm (une des 20 mesures réalisées est rapportée figure 3-23).
D’après la théorie (chapitre 1, p 27), le rayon de la réponse percussionnelle mesure
nm ON 1,45 217 515 61 , 0 61 , 0 = × = ×
λ
. Etant donnée la forte ouverture numérique de l’objectif, et le nombre d’éléments optiques nécessaires à sa fabrication pour atténuer les nombreuses aberrations, notamment chromatiques, nous ne sommes pas étonnés de ne pas être limités par la diffraction. De plus, des éléments supplémentaires ajoutés sur le trajet optique (et notamment une lentille de tube incluse dans le bâti et totalement inconnue) peuvent dégrader cette résolution. De même, on s’aperçoit que la présence de l’intensificateur altère de manière sensible la résolution latérale. Pour l’observation d’échantillons biologiques comme des cellules, cette résolution latérale est néanmoins suffisante.
-200 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 33800 34000 34200 34400 34600 34800 35000 35200 In te n s it é ( u .a .) Position (nm) Mesures Ajustement gaussien Largeur à mi-hauteur r = 376 nm
Figure 3-23 : profil d’intensité d’une bille de 100 nm observée sur la voie résolue en temps (HRI+CCD). La mesure de la largeur à mi-hauteur (376 nm dans ce cas) nous donne la réponse percussionnelle latérale de notre dispositif d’imagerie.
IV.1.2 - Sectionnement optique et résolution axiale
Nous nous intéressons dorénavant à la résolution axiale (ou en profondeur) de notre microscope TIRFLIM. Pour commencer, nous présentons les premières images TIRF en intensité sur des cellules vivantes (figure 3-24), pour montrer la qualité des images obtenues avec cette technique.
Figure 3-24 : image en épifluorescence classique (à gauche) et en TIRF (à droite) de cellules HEK-293 avec une transfection stable CB1R-GFP. Images obtenues avec la caméra EM-CCD.
Nous observons ici une lignée de cellules HEK 293 (Human Embryonic Kindney), qui ont été transfectées avec des récepteurs cannabinoïdes de type I marqués à la GFP (CB1R-GFP) de manière stable (voir le quatrième chapitre sur les applications). Ceci signifie que cette lignée exprime de manière perpétuelle les CB1R-GFP. Ces cellules, qui nous ont été fournies par les chercheurs du Laboratoire de Neurobiologie et Diversité Cellulaire de l’ESPCI à Paris avec qui nous collaborons, sont pour nous un outil indispensable pour l’amélioration de notre système. En effet, des échantillons comme les billes en latex fluorescentes ou les solutions de colorant sont utiles pour cerner le comportement de notre montage, mais l’optimisation du dispositif est réalisée grâce aux échantillons biologiques.
On voit d’ailleurs sur ces photographies qu’avec ce type d’échantillons, il est très facile de savoir si les observations se font en épifluorescence classique ou en TIRF. Les structures plus fines collées à l’interface sont plus apparentes en TIRF. En excitant uniquement les premières dizaines de nanomètres (environ 150 nm) de l’échantillon, nous nous affranchissons complètement de la fluorescence des plans supérieurs et notamment du cytoplasme, ce qui au final améliore le contraste des entités cellulaires proches de la lamelle.
Sur notre montage actuel, nous ne pouvons pas mesurer la profondeur de pénétration du champ évanescent. Cependant, il est possible de l’estimer, en utilisant la formule démontrée en introduction, qui relie la profondeur de pénétration d à la longueur d’onde d’excitation, aux indices des deux milieux de part et d’autre de l’interface, et à l’angle d’incidence :
( )
2 2 2 0 sin 4 ni i nt d − × =θ
π
λ
. A l’interface lamelle - échantillon biologique, nous avons ni =1,50 et nt =1,38, ce qui correspond à un angle critique légèrement inférieure à 67°. Dans le cas de la GFP, l’excitation est réalisée à 480 nm, ce qui nous donne une profondeur de pénétration
nm nm
d(67°,480 )=835 . La plus petite profondeur de pénétration accessible est limitée par l’ouverture numérique de l’objectif. A la limite, c'est-à-dire lorsque nous profitons de l’ouverture numérique de 1,45, l’angle d’incidence maximal à l’interface vaut 75°, ce qui correspond à une profondeur d(75°,480nm)=86nm. Dans le tableau 3-1 sont reportées les profondeurs de pénétration obtenues pour la gamme d’angles accessible avec notre objectif.
10 µm
Chapitre III : Développement et caractérisation d’un microscope…
Angle incident (deg) Profondeur de pénétration (nm)
67 835 68 221 69 161 70 133 71 117 72 106 73 98 74 91 75 86
Tableau 3-1 : profondeur de pénétration du champ évanescent suivant l’angle d’incidence.
Les résultats ont été obtenus par le calcul, en considérant une longueur d’onde d’excitation de 480 nm.
Ainsi, en estimant l’angle de rotation du miroir MT, il est possible d’avoir une valeur approchée de l’angle d’incidence, et donc une estimation de la profondeur de pénétration du champ évanescent. Cette estimation n’est pas très précise, mais vues les faibles variations de la profondeur en fonction de l’angle incident (pour des valeurs supérieures à 69°, ce qui est vraisemblablement notre cas), cette estimation nous donne une idée assez précise de la profondeur de pénétration du champ évanescent pour nos premières expériences. Cependant, il apparaît indispensable de quantifier plus précisément cette grandeur, ce qui fait partie de nos perspectives d’amélioration du montage.