Résolution de la structure des anneaux N 11

1) Première stratégie pour l’obtention des phases : le remplacement moléculaire

La première tentative de résolution de la structure consistait à utiliser la carte de microscopie électronique obtenue à partir des cristaux broyés (Cf. partie III, article I) en utilisant le programme de remplacement moléculaire MOLREP (Vagin and Teplyakov, 2000).

Le remplacement moléculaire « direct » en utilisant la carte de microscopie et les données cristallographiques à 4 Å n’est pas possible car la carte de microscopie est une enveloppe vide. Afin de remédier à cela, un modèle protéique a été construit à l’intérieur même de la carte de microscopie. A cet effet, le fichier de coordonnées d’une protéine (penton de l’adénovirus humain) a été découpé et modifié pour remplir le plus précisément possible la

densité électronique de la carte issue de la microscopie électronique (Figure 31). Aucune solution de remplacement moléculaire n’a pu être établie.

Nous avons pensé que le remplacement moléculaire échouait car le modèle protéique ne contenait pas assez d’atomes. Pour remédier à cela le programme ARP/wARP (Morris et al., 2004) a été utilisé pour ajouter des molécules d’eau au fichier de coordonnées et ceci en vue de remplir le plus possible l’enveloppe de la carte de microscopie. Suite à cela, les statistiques du remplacement moléculaire ont commencé à converger vers une solution plausible

(Rfact=0.44 et CC=0.55). Le programme RAVE (Kleywegt and Jones, 1994) a été utilisé pour

calculer les phases et la carte de densité électronique. L’analyse des cartes de densité électronique a permis d’observer la position des canaux de solvant et des 22 protomères, sans toutefois mettre en évidence une continuité permettant de tracer une chaine protéique (Figure 34 A). Les opérateurs de symétries non cristallographiques n’ont pas pu être déterminés avec une précision suffisante pour améliorer la qualité de la carte de densité électronique.

Figure 31 : « Faux pdb » recalé dans la densité de microscopie électronique. Protéine utilisée : penton de l’adénovirus humain (code pdb : 1X9P)

2) Deuxième stratégie pour l’obtention des phases : Single Anomalous

Diffraction

L’utilisation de la cystéine en tant qu’additif combinée à la quantité importante de sel dans la condition de cristallogenèse a rendu difficile les essais de marquage des cristaux avec des

dérivés d’atomes lourds (Petsko, 1985). La co-cristallisation avec différents atomes lourds (avec ou sans cystéine) s’est elle aussi révélée infructueuse. L’expression d’une protéine sélénomethionylée en système baculovirus/cellules d’insectes n’a pas fonctionné non plus, la sélénométhionine n’étant pas incorporée dans la nucléoprotéine lors de sa surexpression. Le marquage de la protéine par trempage demeurant la seule alternative, des tests en masse de différents dérivés lourds ont été effectués. Les essais de marquage les plus prometteurs sont répertoriés dans le tableau suivant.

Tableau 5 : Résumé des différents essais de marquage avec des dérivés d’atomes lourds.

Le site http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/had/heavyatom.html a été consulté pour le choix de certains dérivés lourds.

Sel de métal testé Résultat Brome (NaBr, BrLi)

Enrobe la protéine ^{Signal très faible} Uranium (acétate d’uranyle) Détruit les cristaux Mercure (EMTS, HgCl2, CH3HgCl,)

Interagit avec les cystéines et l’ARN

Pas de signal et non isomorphe (co-cristallisation) Signal anomal extrêmement faible (trempage) Cadmium (CdCl2, Cd(NO3)2) Pas de signal (co-cristallisation et trempage)

Platine (PtCl2, PtSO4, cis-Pt) Aucun signal

Or (AuCl2, KAuCl4) Présence d’un signal anomal

Apres intégration et mise à l’échelle des intensités, la fixation du marqueur anomal testé est vérifiée avec le programme XPREP (Bruker AXS, Madison, WI). Ce programme calcule un rapport signal anomal / bruit. Si ce rapport est supérieur à 1, le signal anomal est significatif. Dans le cas de l’or, l’énergie du faisceau de rayons X à été réglée au niveau du pic

d’absorption LIII de l’or (λ = 1.037, Figure 32). Le marquage avec le dérivé d’or AuCl₂ s’est

révélé positif (une seule fois). L’analyse du jeu de données Au (6Å de résolution) a permis de détecter la présence d’un pouvoir de phasage significatif de 1.44 jusqu’à 10 Å.

Figure 32 : Courbes d’intensité du signal anomal de l’or.

Le programme ShelxD (Sheldrick, 1997) a permis de trouver 22 sites pour les atomes d’or. Ces 22 atomes lourds forment 2 anneaux parfaits de 11 atomes permettant d’affirmer que chaque protomère de nucléoprotéine fixe un atome d’or (Figure 33). L’ultrastructure du complexe étant un anneau, l’obtention d’un ou plusieurs cercles d’atomes était prévisible. Malgré les apparences, les deux cercles définis par les 22 atomes d’or ne sont pas superposables et ne peuvent être reliés par une simple opération de symétrie. Ceci nous a

permis de confirmer que le groupe d’espace était bien P21212 avec une pseudo-symétrie

suivant l’axe l générée par la présence de deux anneau protéiques au sein de l’unité asymétrique.

Figure 33 : Sites forts d’atomes d’or trouvés par ShelxD et affinés avec SHARP. A : vue de dessus. B : vue de coté.

Le programme SHARP (Bricogne, 1997) a ensuite été utilisé pour affiner la position des sites d’atomes lourds et pour étendre les phases à 6 Å. Le programme DM a permis d’affiner les phases ainsi que les operateurs de symétrie non cristallographique. La carte de densité électronique obtenue après ces étapes était très prometteuse et permettait d’observer des chaines individuelles pour chaque protomère ainsi que de la densité électronique pour les

hélices α. Ces phases, à 6 Å, ont ensuite été étendues en utilisant les données natives à 4 Å.

La carte de densité électronique résultante était continue et a permis la modélisation d’une chaine poly-alanine dans la densité électronique à l’aide du programme de construction COOT (Emsley and Cowtan, 2004) (Figure 34 B).

Figure 34 : Cartes de densité électronique expérimentales.

A : Carte obtenue suite au remplacement moléculaire avec le modèle issu de la microscopie électronique.

B : Carte obtenue après extension des phases à 3.5 Å.