La mutation S714R, en combinaison avec D701N, permet l’augmentation de l’acti- vité de la polymérase grâce à l’augmentation de l’interaction avec les ARN coiffés in vitro [Zhang et al., 2012]. Un autre mécanisme d’action de la mutation S714R a ré- cemment été proposé, suggérant que son rôle soit de faciliter la séparation du peptide NLS du domaine NLS, événement nécessaire à l’interaction avec l’importine α. En effet, l’acide aminé 714 est situé à proximité de R737. La mutation S714R pourrait donc, via une interaction électrostatique, repousser la chaîne latérale de l’acide aminé R737 et ainsi permettre une meilleure exposition du peptide NLS [Czudai Matwich et al., 2014]. Cette hypothèse est soutenue par l’étude montrant que la mutation S714R augmente l’association du domaine NLS à l’importine α in vitro [Boivin and Hart, 2011].
5
Objectifs
La structure du double domaine 627-NLS a été extensivement caractérisée par cristallographie aux rayons X. Cependant, les descriptions existantes ne sont pas suffisantes pour comprendre comment cette protéine effectue sa fonction in vivo. En effet, l’existence d’une conformation différente de celle cristallisée est nécessaire pour expliquer son association à l’importine α. De nombreux essais ont été réalisés au laboratoire pour cristalliser le complexe 627-NLS/importine α, sans jamais donner de résultats, suggérant une flexibilité et une dynamique trop importantes. C’est pourquoi nous avons entrepris une étude du domaine 627-NLS en solution, par des techniques basse et haute résolution, telles que la RMN, le SAS et le FRET. Un premier objectif de ma thèse est de déterminer la dynamique du 627-NLS en solution et d’obtenir une description structurale des différents états présents. Un second objectif est de déterminer la façon dont cette dynamique permet l’interaction avec l’importine α et de décrire la structure du complexe.
Par ailleurs, de nombreuses mutations dans le domaine 627-NLS ont lieu lors de l’adaptation inter-espèces du virus. Les souches humaines et aviaires choisies pour cette études comportent 10 de ces mutations dans le double domaine. Nous avons cherché à observer leur effet d’une part sur la dynamique du 627-NLS en solution,
et d’autre part sur son interaction avec l’importine α. En effet, des interactions préférentielles du 627-NLS provenant de virus aviaires ou humains avec certains iso- formes de l’importine α ont été mises en évidence dans la littérature, mais les bases moléculaires de celles-ci restent floues. C’est pourquoi nous avons choisi d’étudier non seulement l’affinité de l’interaction de l’importine α avec le 627-NLS humain et aviaire, mais également avec des simples mutants et des combinaisons de mutants dé- finis selon l’évolution naturelle du virus. De plus, l’interaction 627-NLS/importine α s’effectue à plus haute température chez les oiseaux (40◦C) que chez l’homme (33◦C). Pour cette partie, le troisième objectif de ma thèse est de déterminer par SPR si l’affinité de l’importine α avec le 627-NLS est influencée par l’isoforme d’impor- tine α utilisé combiné à la température à laquelle est effectuée l’interaction. Enfin, une technique permettant la détermination rapide d’affinités et peu gourmande en matériel biologique, le MST (Microscale thermophoresis), permettra de déterminer si un effet de certaines mutations évolutives du 627-NLS sur son interaction avec l’importine α peut être identifié.
Les résultats seront présentés en deux chapitres.
Le premier correspond à l’étude de la dynamique ainsi qu’à la description structurale du 627-NLS aviaire et de son complexe avec l’importine α en solution. Il commencera par la publication rédigée lors de ma thèse, puis je présenterai certains résultats com- plémentaires à propos du 627-NLS aviaire, mais aussi humain. Je présenterai dans une seconde partie les résultats concernant l’interaction du 627-NLS à différentes températures avec différents isoformes de l’importine α, ainsi que l’interaction de l’importine α avec les mutants évolutifs du 627-NLS.
Le second chapitre présente quant à lui la résolution par cristallographie aux rayons X du domaine 627 issu d’une souche de la grippe B et sa comparaison avec les structures du même domaine issu d’autres souches. Ce dernier travail a été effectué lors d’une collaboration dans le cadre de la résolution de la structure cristallogra- phique de la polymérase entière.
Chapitre
III
Résonance Magnétique Nucléaire
1
Généralités
La résonance magnétique nucléaire (RMN) est une puissante technique d’analyse à résolution atomique des molécules en solution, basée sur la mesure des propriétés magnétiques de certains noyaux soumis à un champ magnétique intense.
Une des caractéristiques des noyaux est le spin, représenté par le vecteur−→I , dont la norme est exprimée en fonction du nombre quantique de spin I et de la constante de Planck h.
k−→I k = h
2π ×p(I(I + 1)) (3.1)
Les noyaux possédant un spin nucléaire non nul sont visibles en RMN. Cependant,
les noyaux ayant un spin supérieur à 1/
2 possèdent un moment quadripolaire qui
induit des couplages complexes et un élargissement des raies. Il est donc beaucoup plus difficile d’avoir une bonne résolution du signal. C’est pourquoi, en RMN des protéines, on utilise préférentiellement les noyaux possédant un spin 1/
2, tels que le 15N ou 1H. Cependant, à l’exception des protons, la plupart des isotopes de spin1/
2 intéressants pour l’observation des molécules biologiques ont une abondance natu- relle très faible. Des techniques ont donc été développées pour enrichir les protéines
d’intérêt en 15N ou en 13C, permettant une acquisition de données dans un temps
raisonnable.
Une autre caractéristique intrinsèque des noyaux importante pour la RMN est le moment gyromagnétique, γ. Il peut être positif ou négatif, est fixe pour un type de noyaux donné (1H, 15N,. . . ), et influe sur le moment magnétique −→µ associé au spin selon l’équation suivante :
−
2
Résonance des noyaux à spin demi-entier
Lorsqu’un champ magnétique −B→0 est appliqué (par convention selon l’axe z) à un échantillon, il interagit avec le moment magnétique des spins à une énergie E telle que :
E = −γIzB0 (3.3)
Avec Iz, la projection de − →
I sur l’axe z, qui est exprimée en fonction de mI, le nombre quantique magnétique :
Iz = mIh
2π , mI ∈ [−I, −I + 1, ..., I − 1, I] (3.4)
Dans le cas d’un noyau de spin1/
2, mI ne peut prendre que deux valeurs : +1/2 (état β) ou −1/ 2 (état α) : Eα = − 1 2γB0~ et Eβ = 1 2γB0~ avec ~= h 2π (3.5) E B0 0 Eβ = 12γB0~ Eα= −12γB0~
Figure 3.1– Levée de dégénerescence des états de spin.
Le champ magnétique−B→0 provoque une séparation énergétique des états de spin α
et β.
Comme la différence d’énergie entre les états de spin est directement proportion- nelle au champ magnétique appliqué, plus le champ −B→0 est intense, plus grande est la différence d’énergie entre l’état α et l’état β (Figure 3.1). De plus, le champ ma- gnétique « ressenti » par les atomes de l’échantillon n’est pas tout à fait B0 mais Bef f = B0(1 − σ). En effet, il est modulé par la constante d’écran σ due aux élec- trons du nuage électronique, aux atomes vicinaux, aux liaisons, etc. C’est grâce à cet effet que l’étude des protéines en RMN est possible, chaque atome étant ainsi distinguable dans le spectre enregistré.
Les niveaux α et β étant dégénérés, il est possible d’induire une transition grâce à l’énergie :
∆E = γB0~= hν0 (3.6)
On peut exprimer la fréquence de la radiation nécessaire, ν0, en fréquence angulaire, ω0 :
ν0 = γB0
2π donc ω0 = γB0 (3.7)
La fréquence ω0 est appelée fréquence de Larmor et satisfait la “condition de ré-
sonance”, c’est-à-dire qu’elle permet d’induire la transition entre état α et β. Par exemple, pour un champ magnétique de 14,4 T, la fréquence de Larmor des protons est de 600 MHz.
3
La spectroscopie par RMN
Une fois l’échantillon soumis à un champ magnétique −B→0, un équilibre est at- teint. On peut calculer la différence de population entre les deux états obtenus par l’équation de Boltzmann : Nα Nβ = exp ∆E kBT (3.8) Il n’y a qu’un très faible excès de la population α par rapport à la population β, et c’est cette différence qui est utilisée par la spectroscopie par RMN : c’est pourquoi cette technique manque de sensibilité. C’est pour pallier ce problème que des champs −→
B0 toujours plus élevés sont recherchés, augmentant la différence de population
obtenue à l’équilibre et donc la sensibilité de la technique. Le spectromètre RMN de plus haut champ fabriqué actuellement a un champ de 23,5 T (1 GHz).
Au niveau macroscropique, l’excès de population α crée une magnétisation nette selon l’axe z, −→M0 (Figure 3.2A,B). Il est possible de perturber cette dernière grâce à l’application d’un champ électromagnétique à la fréquence de Larmor dans le plan xOy, nommée le champ −B→1. Le retour des spins à l’équilibre (relaxation) génère un courant dans une bobine placée dans le plan xOy. C’est sur ce phénomène que repose le principe de la spectroscopie par RMN (Figure 3.2C).
Expérimentalement, une impulsion d’une courte durée à une fréquence donnée (porteuse) va permettre d’exciter une certaine gamme de fréquences autour de cette porteuse, soit tous les noyaux contenus dans l’échantillon. Le signal collecté contient donc plusieurs fréquences et est appelé le free induction decay (FID). Une trans- formée de Fourier est ensuite utilisée pour convertir ce FID en fréquences (Figure 3.3).
−→ B0 x y z −→ M0 A C x y z −→ B1
sigémisnal
B
x y
z
Figure 3.2– Représentation géométrique des spins dans le champ B0 dans le référentiel du
laboratoire (A et B) ou rotatif, à la fréquence de Larmor (C). A. A l’équilibre, les spins précessent à la fréquence de Larmor (rouge, noyau possédant un moment gyromagnétique γ positif). B. Sous l’effet de−B→0, un excès de spins est aligné de la
même façon, résultant en une magnétisation macroscropique nette M0, en rouge.
C. Lors de la perturbation du système par une radiofréquence−B→1 à la fréquence
de Larmor dans le plan xOy, les spins sont perturbés et la magnétisation moyenne (rouge) induit un courant détectable, ici en bleu.
ν0
TF
Temps Fréquences
Figure 3.3– Déconvolution de spectre utilisant la transformée de Fourier.
Passage du domaine du temps (à gauche) au domaine des fréquences (à droite) grâce à la transformée de Fourier.
4
Les spectres multidimensionnels
Lors de l’étude des macromolécules biologiques par RMN, les spectres obtenus sont très complexes car ce sont des échantillons contenant un très grand nombre de noyaux. Il est donc très difficile de résoudre les signaux individuels observés sur un spectre à une seule dimension. C’est pourquoi en RMN des protéines, en sus du proton, l’azote 15 et le carbone 13 sont utilisés pour permettre l’acquisition de spectre contenant 2, voire 3 dimensions ou plus (Figure 3.4).
11 10 9 8 7 6 5 1H (ppm) 15 N (p pm) 132 130 128 126 124 122 120 118 116 114 112 110 108 106 104 102 100
Figure 3.4– Spectres à une et deux dimensions.
En haut, un spectre à une dimension (1H) de l’ubiquitine. En bas, un spectre à
deux dimensions (1H-15N HSQC) du même échantillon. Le spectre 2D permet de
résoudre tous les signaux observés là où le spectre 1D ne permet que des observa- tions d’ordre général.
Par exemple, l’HSQC pour heteronuclear single quantum coherence est l’une des expériences les plus couramment utilisées en RMN des protéines en solution. Elle per- met d’obtenir une corrélation entre le proton et l’azote, lorsque leur couplage scalaire est suffisant. Dans une protéine, on trouve ce couple d’atomes une fois par liaison amide (sauf pour les prolines), et dans la chaîne latérale de certains acides ami- nés (arginines, lysines, glutamines, asparagines, tryptophanes et histidines). Dans le spectre HSQC d’une protéine, on a donc des signaux correspondant aux chaînes latérales (à des positions caractéristiques, et donc facilement identifiables), et un signal par acide aminé. Cette expérience simple permet d’obtenir des informations directes sur le repliement de la protéine (par exemple, les protéines désordonnées ont une dispersion spectrale faible dans la dimension proton) mais elle constitue surtout la base de la plupart des expériences de RMN des protéines en solution.