Réponse des cellules fibroblastiques MRC-5

Lors de cette étude, il s’agira de comparer l’effet des extraits d’Orgon, i.e. extraits organo-minéraux et les extraits dessalés où les molécules organiques ont été concentrées, sur les fibroblastes (MRC-5). Le but est de démontrer que ces extraits peuvent stimuler la différenciation des fibroblastes vers un phénotype ostéoblastique, i.e. de cellules capables de minéraliser, et mettre ainsi en évidence le pouvoir ostéoinducteur des molécules organiques de calcification. . L’activité de ces extraits est comparée aux blancs, du carbonate de calcium pur, extrait d’après le protocole à l’eau (on obtient la fraction minérale nommée BlanW) et d’après le protocole à l’éthanol (on obtient la fraction minérale nommée BlanE). La dexaméthasone connue pour induire l’ostéogénèse des cellules de la lignée ostéoblastique est utilisée comme contrôle positif. Les marqueurs dosés afin de démontrer la différenciation osseuse vers le phénotype ostéoblastique sont la prolifération cellulaire et la stimulation de l’activité phosphatase alkaline (PAL). Si une augmentation de l’activité PAL est liée à une baisse de la prolifération cellulaire on est donc en phase de différenciation des fibroblastes. Les dosages sont effectués à J1, J3, J6, J9 et J12.

Le contrôle négatif réalisé par ajout d’eau milliQ dans le milieu de culture montre une prolifération cellulaire en hausse et aucune activité PAL (figure 42a): les cellules n’entrent pas en phase de différenciation. La dexaméthasone, inducteur de l’ostéogénèse, montre que la prolifération cellulaire n’est pas affectée (Figure 42b). L’activité PAL mesurée avec la dexaméthasone nous montre une stimulation de l’activité PAL après 12 jours de traitement de Dex à 100mM: la lignée de fibroblastes MRC-5 est capable de répondre à ce facteur de différenciation.

Chapitre VI : Activité des extraits de biocalcaires sur l’ostéogenèse

Figure 42. Evolution au cours du temps de l’activité PAL (histogramme) et de la quantité de protéines totales (courbe) des fibroblastes en réponse au contrôle négatif (a) et au contrôle positif, la dexaméthasone (b).

Les 2 blancs montrent une prolifération cellulaire en hausse stimulée par le calcium. Les cellules sont en phase de prolifération (Figure 43). L’activité PAL mesurée sur les BlanW et BlanE ne montre aucune activité: les cellules n’entrent pas en phase de différenciation.

Figure 43. Evolution au cours du temps de l’activité PAL (histogramme) et de la quantité de protéines totales (courbe) des fibroblastes en réponse au blanW (a) et au blanE (b).

Pour les 3 concentrations de l’extrait OrgonW, les tests BCA montrent une baisse significative de la prolifération cellulaire dès la concentration de 239µg/ml de protéines et ceci dès le 3e jour (figure 44). L’activité PAL mesurée sur les extraits OrgonW à 239 et 774 µg de protéines/ml montre une augmentation de celle-ci dès 12 jours. Cette activité est de plus doublée avec OrgonW[744] (i.e. 744µg de protéines/ml) par rapport à OrgonW[239]. L’extrait OrgonW[1200] montre une stimulation de l’activité PAL dès 6 jours: il y a donc un effet dose-dépendant. Cependant dans le cas de la concentration en protéines la plus élevée, on observe une baisse de l’activité PAL à J9 : l’échantillon est certainement trop concentré.

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143 De part la baisse de la prolifération cellulaire et l’augmentation de l’activité PAL, les extraits OrgonW[239] et OrgonW[774] induisent une différenciation des fibroblastes vers le phénotype ostéoblastique.

Figure 44. Evolution au cours du temps de l’activité PAL (histogramme) et de la quantité de protéines totales (courbe) des fibroblastes en réponse à l’extrait OrgonW à 239µg de protéines/ml (a), 774µg de protéines/ml (b)

et 1200µg de protéines/ml (c).

Les extraits OrgonWad et OrgonE montrent des effets similaires (annexes 1a et 1b), i.e. une entrée en phase de différenciation vers le phénotype ostéoblastique qui est dose-dépendante. De même, les extraits les plus concentrés, OrgonWad[1300] et OrgonE[857] provoquent des irrégularités dans l’activité PAL : ces échantillons sont certainement trop concentrés.

Figure 45. Evolution au cours du temps de l’activité PAL (histogramme) et de la quantité de protéines totales (courbe) des fibroblastes en réponse à l’extrait OrgonEd à 388µg de protéines/ml (a), 969µg de protéines/ml (b)

et 1000µg de protéines/ml (c).

Les courbes des tests BCA pour les extraits OrgonEd aux concentrations de 388 et 1000µ g/ml de protéines montrent une baisse de la prolifération cellulaire (Figure 45a et 45c). Cependant,

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le test BCA réalisé sur l’extrait OrgonEd concentré à 969µ g de protéines/ml montre une hausse (figure 45b): les cellules sont toujours en phase de prolifération et ne sont pas entrées en phase de différenciation. De plus, l’activité PAL mesurée sur les extraits OrgonEd aux 3 concentrations montrent une activité PAL à partir de 12 jours. OrgonEd 969, montrant une hausse de la prolifération osseuse et une faible activité PAL, n’est pas entré dans une phase de différenciation précoce. Les 2 autres concentrations d’OrgonEd induisent une baisse de la prolifération cellulaire et une hausse de l’activité PAL qui reste cependant inférieure à celle mesurée avec l’inducteur d’ostéogénèse, la dexaméthasone. L’échantillon OrgonEd sera donc abandonné pour les prochains tests sur les cellules de la lignée ostéoblastique.

Conclusion sur les réponses des cellules fibroblastiques MRC-5

OrgonW, OrgonWad et OrgonE induisent une différenciation des fibroblastes vers le phénotype ostéoblastique qui est dose-dépendante et ceci plus rapidement qu’avec l’inducteur standard, la dexaméthasone. Il y a donc une forte accélération du processus de différenciation stimulée par les extraits organo-minéraux et l’extrait OrgonWad, concentrant les molécules organiques.

Les Blancs obtenus à partir d’un carbonate de calcium pur et extraits d’après les protocoles à l’eau et à l’éthanol ne montrent aucune activité phosphatase alcaline et une prolifération cellulaire en hausse: le calcium permet d’expliquer la prolifération cellulaire en revanche la fraction organique contient des molécules « signal » qui permettent l’engagement dans la voie de différenciation des cellules osseuses.

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