Chapitre III : Discussion
1.5 Quelle est la réponse des cellules endothéliales au stress provoqué par les GCs ?
voie de signalisation il induit la mort. Très souvent on utilise des techniques visant la voie des caspases mais celle-ci, notre laboratoire l’a également démontré (121, 207, 272), n’est pas activé dans la totalité des situations. C’est pourquoi nous avons analysé différentes voies de mort cellulaire, en essayant de cibler les plus associées aux GCs et/ou aux cellules endothéliales.
Etant données les concentrations supraphysiologiques utilisées dans nos travaux, nous avons vérifié, dans un premier temps, la mort cellulaire par nécrose, déjà impliquée par d’autres cellules dans ce type de toxicité (126). Nous avons montré que seule la Dexa (0.1 mg/ml) est capable de provoquer une libération significative de lactate déshydrogénase, une enzyme intracellulaire libérée lors de la nécrose, dans les HMEC par rapport aux cellules non traitées (31.17%; **P≤0.01). De manière surprenante, la TA à la concentration de 0.1mg/ml, avec des propriétés physico-chimiques et biologiques semblables à la Dexa et qui, comme cette dernière forme également des cristaux insolubles, n’induit pas ce genre de mort, comme nous le commenterons plus tard.
153
Par la suite nous avons étudié la mort cellulaire par autophagie en cherchant l’apparition de ces marqueurs dans les HMECs. Notre contrôle positif de l’activation de l’autophagie a été fait en mettant les cellules en culture avec un milieu dépourvu d’acides aminés. Evidement, ce type d’induction de l’autophagie correspond à une voie bien précise, celle dépendante de mTOR (149), qui n’est pas forcement celle activée dans nos cellules, mais notre but était uniquement d’induire l’apparition de vésicules autophagiques capables d’être marquées par LC3. En immunocytochimie, aucune vésicule autophagique n’a été détectée dans les cellules traitées par les GCs. L’ensemble de ces éléments témoignent de la non activation de l'autophagie dans notre modèle.Plusieurs études incriminaient les GCs dans l’induction de stress oxydatif et de l’apoptose dans les cellules endothéliales (120-121, 124, 273-275).Cependant, les chercheurs évaluent souvent l’apoptose en analysant uniquement des marqueurs associés à la mort dépendante des caspases (Caspase 3 activée, un marquage TUNEL positif), ce qui exclut la cytotoxicité induite par l’activation d’autres voies de mort indépendantes des caspases comme celles induites par les DNase II (présentées en introduction). Par exemple, Hartnett et al ont montré que la TA à forte dose induit un changement de la morphologie et une baisse significative de la viabilité des cellules endothéliales de la rétine humaine (colorées au bleu trypan) (124). De façon un peu paradoxale (pour ceux qui considèrent que toute apoptose passe par l’activation des caspases), aucune activation de la caspase-3 n’a pu être décelée. Ce résultat suggère, à nos yeux, l’implication d’une voie différente dans le destin cellulaire et pas une absence de mort cellulaire ou un manque de toxicité. Pour ces raisons nous avons ciblé à la fois l’apoptose dépendante des caspases, marquée de façon générale par l’activation des caspases effectrices comme la caspase-3, et la mort cellulaire indépendante des caspases, notamment celles engageant la voie AIF et la LEI/L-DNase II, une endonucléase qui se transloque dans le noyau et dégrade l’ADN.
Pour étudier ce point nous avons, tout d’abord, essayé d’établir la condition apoptotique de ces cellules. Un des marqueurs de l’apoptose est la dégradation de l’ADN en oligonucléosomes comme expliqué précédemment (voir introduction chapitre I.3 La mort cellulaire). Nous avons exploré l’état de l’ADN génomique des HMECs par électrophorèse sur gel d’agarose qui révèle une nette fragmentation du matériel génomique dans les cellules traitées avec la Dexa et la Dexa-Ph. Cette fragmentation était moins marquée, mais néanmoins existante, dans les cellules exposées à la TA. Nous n’avons pas observé une dégradation de l’ADN dans les cellules traitées avec l’hydrocortisone.
154
Par la suite, les observations des immuno-marquages ont révélé la présence de la caspase-3 activée dans les cellules traitées avec la Dexa et la Dexa-Ph alors que la TA et l’Hydro montraient un marquage comparable au contrôle. Ce résultat est confirmé au niveau protéique par western blot. Notre contrôle positif pour l’activation de la caspase est obtenu par l’exposition des HMEC à l’Etoposide, un inhibiteur de la topoisomérase II, utilisé en chimiothérapie et déclencheur classique de la voie des caspases (276). Dans l’optique de corroborer les résultats précédents, nous avons vérifié le clivage de la PARP, l’une des cibles intracellulaires de la caspase-3 activée. Au cours de l’apoptose, la PARP est clivée par les caspases effectrices -3 et -7 (277). La réparation de l’ADN est alors compromise et l’inactivation de la PARP permet également de préserver les stocks d’ATP qui sont nécessaires au déroulement de l’apoptose (278).Le résultat obtenu concorde parfaitement avec ceux déjà trouvés puisque le western blot révèle la présence de la fraction clivée de cette protéine dans les cellules exposées à la Dexa et la Dexa-Ph uniquement. Il est intéressant de noter ici que les cellules étudiées sont parfaitement capables de déclencher la voie de caspases. Il ne s’agit pas là de cellules qui auraient un empêchement majeur, comme c’est le cas des MCF-7, par exemple, qui n’expriment pas la caspase 3 (145), mais de réponses différentes à des molécules pourtant similaires.
Etant donné l’absence d’activation des caspases avec certains GCs, nous avons regardé les voies alternatives de l’apoptose, les voies indépendantes des caspases. Nous en avons analysé deux : AIF et L-DNase II. Ce choix se base sur nos expériences précédentes (121). De ce fait, nous avons cherché la libération d’AIF de la mitochondrie et sa translocation nucléaire ainsi que l’activation de la LEI/L-DNase II, à travers sa translocation nucléaire à partir du cytoplasme.
AIF a montré un marquage cytoplasmique pointillé correspondant à sa localisation mitochondriale, aussi bien dans les cellules traitées que contrôle. De plus, l’analyse par Western Blot montre AIF sous sa forme clivée uniquement dans les cellules exposées à la Staurosporine (souvent employé comme inducteur de la voie AIF et que nous avons utilisé comme témoin positif). Aucun traitement GC n’a induit le relargage d’AIF dans le cytoplasme, indiquant que cette voie n’est pas activée dans nos conditions expérimentales. Après avoir constaté que l’exposition des HMEC aux GCs n’active ni l’autophagie ni AIF, qu’elle déclenche la voie des caspases avec la Dexa et la Dexa-Ph et que seule la Dexa est
155
capable de provoquer la nécrose, nous constatons que la TA ne déclenche pas les mécanismes de mort classiques alors que sa toxicité sur les cellules à été largement démontrée. Nous avons donc exploré la voie de la LEI/L-DNase II (124, 258, 279-280) (281).Nous résultats ont montré que cette voie est activée avec tous les glucocorticoïdes de notre étude. En effet, la translocation de la LEI dans le noyau a été révélée par un marquage immunocytochimique spécifique et par la présence dans le western blot de sa forme endonucléase clivée, L-DNase II (35kDa), dans la fraction nucléaire. L’activation de cette voie explique donc la mort des cellules traitées par la TA, car c’est la seule voie qui s’active dans ces conditions. Il est quand même intéressant de noter que la L-DNase II s’active dans tous les traitements. Ceci dit, il est fort possible que sa participation à la mort effective des cellules ne soit pas la même dans tous les cas. En effet, la voie de la LEI/L-DNase II est une voie assez lente, comparée à celle des caspases. De ce fait, s’il y a en même temps activation de la voie des caspases, il est fort possible que ce soit cette voie qui l’emporte, en termes d’efficacité pour conclure la mort de la cellule.